Biyokimyasal Yöntemler

Mikrobiyolojide biyokimyasal yöntemler, mikroorganizmaların biyokimyasal özelliklerini, metabolizmalarını, genetik yapılarını ve fizyolojilerini anlamak için kullanılan çeşitli teknik ve yaklaşımları içerir. Bu amaçla uygulanan yöntemler, mikrobiyolojide moleküler düzeydeki temel süreçleri incelemek, mikroorganizmaların yaşam döngülerini, adaptasyonlarını ve enfeksiyon mekanizmalarını açıklamak için vazgeçilmez araçlardır. Mikrobiyolojide biyokimyasal yöntemler, enzim kinetiği, protein sentezi, metabolik yollar ve genetik düzenlemeler gibi birçok alanda bilgi edinilmesini sağlar.

Karbonhidrat Fermentasyon Testleri, Aktivite Testleri, Protein ve Amino Asit Metabolizma Testleri ve diğer biyokimyasal testler mikrobiyolojide kullanılan temel biyokimyasal yöntemlerdir. 

Fermantasyon sonucu ortaya çıkan ürünler arasında, farklı türde asitler, nötral moleküller ve gazlar yer alır. Örneğin; asitler arasında laktik asit, asetik asit ve bütirik asit; nötral ürünler arasında etanol ve aseton; gazlar arasında ise karbondioksit ve hidrojen bulunabilir.

Mikrobiyolojik karakterizasyon çalışmalarında, çeşitli monosakkarit ve disakkarit türleri (glukoz, galaktoz, laktoz, maltoz, fruktoz, sukroz ve mannoz gibi) %1 konsantrasyonunda hazırlanmış 5 ml’lik sıvı besi ortamında incelenir. Analiz süreci, incelenen karbonhidrat çözeltisine 0.1 ml hacminde seçilen mikroorganizma kültürünün ve spesifik indikatör solüsyonlarından (Andrade indikatörü veya Brom Timol Mavisi gibi) birkaç damla eklenmesiyle başlar. Karışımın 37°C’de 1 ila 10 gün süresince inkübasyonu gerçekleştirilir. Inkübasyon periyodunun sonunda, karbonhidratların mikroorganizma tarafından metabolize edilip edilmediği, asidifikasyon ve/veya gaz üretimi yoluyla belirlenir. Gaz üretiminin varlığı, Durham tüpünde biriken gaz kabarcıkları ile saptanır. Deney sonuçlarını değerlendirirken çeşitli pH indikatörlerinden yararlanılır.

Andrade indikatörü, asit fermentasyonda kırmızı, bazik ortamda renksiz ve nötr ortamda sarı renk vermektedir.

Bromtimol Mavisi (BTB)İ asit fermentasyonda  sarı , baz ortamda mavi-koyu mavi ve nötr ortamda ise açık mavi renk vermektedir.

İndikatör: Ortamın asidik veya bazik olmasına göre renk değiştiren belirteçlerdir.

Mikrobiyolojide enzim aktivite testleri, bakteri ve mikroorganizmaların enzimatik aktivitelerini tanımlamak ve ölçmek için kullanılır. Bu testler katalaz, oksidaz, üreaz ve koagülaz gibi testleri içerebilir. Mikrobiyal enzimlerin değerli ürünlerin üretiminde çeşitli faydalı kullanımları vardır ve bu aktiviteler basit kimyasal analizlerle gösterilebilir.

Bu test, bazı mikroorganizmalarca sentezlenen katalaz enzimini saptamak amacıyla yapılır
ve tanımlanmasında kullanılır. Bu enzim genellikle sitokrom ihtiva eden aerobik bakterilerde ve bazı
fakültatiflerde bulunur. Katalaz deneyi, katalaz enziminin hidrojen peroksit (H₂O₂)i su (H₂O) ve
oksijen (O₂) gazına çevirme yeteneğini test eder. Bu reaksiyon, katalaz enzimi varlığında hızlı bir
şekilde gerçekleşir ve özellikle aerobik ve fakültatif anaerobik bakterilerde katalaz aktivitesinin gösterilmesi için kullanılır.

1. Tüpteki veya petrideki agarlı kültür yüzeyine 1ml %3’lük H2O2 aktarılır. Hava kabarcıklarının
görülmesi sonucun pozitif olduğunu gösterir.

Kabarcıklar şeklinde gaz çıkışı varsa;

katalaz (+), yoksa katalaz (-)

Staphylococcus spp. katalaz (+) Streptococcus spp. katalaz (-)
2. Bir lam üzerine %30’luk hidrojen peroksit damlatılır ve 1 koloni ile süspanse edilir, hava kabarcıklarının çıkışı testin pozitif olduğunu gösterir. Şüpheli durumlarda inceleme, mikroskop altında en küçük büyütmeli objektif kullanılarak yapılabilir. Lam üzerinde yapılan testler, dikkatli olunmazsa sağlık açısından sakıncalar yaratabilir. Bakterilerin hava kabarcıklarıyla birlikte sıçrayarak çalışanları enfekte etme tehlikesi vardır.

Test sonunda; hidrojen peroksit eklendikten sonra kabarcık oluşumu, reaksiyonun pozitif olarak değerlendirilmesine neden olur.

pH: Bir çözeltinin asitlik veya bazlık derecesini tarif eden ölçü birimidir. pH’in açılımı net olarak bilinmese de genellikle “potential of hydrogen” yani “hidrojenin gücü” olarak tarif edilebilir.

Klinik mikrobiyoloji laboratuvarında Oksidaz testi, sitokrom oksidaz enzimi üretme yeteneğine
sahip mikroorganizmaların belirlenmesinde yardımcıdır. Test, oksidaz pozitif Pseudomonacea ve
negatif Enterobacteriacea familyalarını ayırt etmeye yardımcı olur. Organizmanın oksidaza sahip
olup olmadığı organizmanın kimliğine dair önemli ipucudur.

İncelenen bakteride bu enzim bulunuyorsa ayracı indofenol mavisi’ne oksitler ve mavi renk açığa çıkar.

Direkt Plak Tekniği: Bu yöntemde, seçilen oksidaz ayracından 2-3 damla doğrudan bakteri
kolonisine uygulanır. Bu doğrudan uygulama, kolonide oksidaz enziminin varlığını hızlı bir şekilde
gözlemlemeye olanak tanır.

İndirekt Strip Tekniği: Oksidaz testi için kullanılan ikinci bir yöntemdir. Burada, ayracın süzgeç kâğıdına emdirildiği ve ardından bu kâğıdın üzerine bakteri kolonisinin tatbik edildiği indirekt bir teknik kullanılabilir. Bu yöntem, özellikle oksidaz aktivitesinin belirlenmesinde önerilen ve tercih edilen metottur.

Oksidaz testinin pozitif kabul edilmesi için, bakteri kolonisi ile temas eden süzgeç kâğıdı ya da
oksidaz ayracı uygulanan koloni alanının 10 saniye içinde koyu mavi renge dönüşmesi gereklidir. Eğer renk değişimi 60 saniye içerisinde meydana gelirse, testin güvenilirliği için tekrarlanması önerilir. 60 saniyeden daha uzun sürede meydana gelen renk değişimleri ise değerlendirme dışı bırakılmalıdır.

H. pylori tarafından üretilen üreaz enzimi, üreyi amonyak ve CO2’ye ayırır; bu nedenle radyoaktif
olarak işaretlenmiş CO2’nin varlığı, H. pylori’nin varlığını gösterir. NH4 atım testinde, hasta radyoaktif olarak işaretlenmiş azot içeren üre tüketir. H. pylori tarafından midede üretilen amonyak, kana emilir, idrarda atılır ve idrarda radyoaktif olarak işaretlenmiş NH4 miktarı ölçülür.

Üreaz testinde amonyak oluşumu, indikatör boyaları ve Nessler ayıracı gibi belirleyici maddeler kullanılarak tespit edilir.

Koagülaz testi; Staphylococcus aureus’u diğer stafilokok türlerinden ayırmada kullanılan önemli ve uygulaması kolay bir yöntemdir.

Koagülaz Bağlanma Testi (Lam Test):Bu yöntemde, seçilen bakteriyel koloni, mikroskobik lamın iki farklı bölümüne yayılır. İlk bölgeye bir damla izotonik NaCl çözeltisi, ikinci bölgeye ise insan veya tavşan plazması damlatılır. Her iki örnek de görsel ve mikroskobik inceleme altında aglütinasyon (topaklaşma) belirtileri açısından karşılaştırmalı olarak değerlendirilir. Koagülasyonun 5 saniye içinde meydana gelmesi, testin pozitif olduğuna işaret eder. 2 dakika içerisinde koagülasyon gözlenmezse, test negatif olarak kabul edilir. Pozitif sonuçlar, plazma içermeyen kontrol kolonisi ile daima karşılaştırılmalıdır. Her iki örnekte de pozitif sonuç alınması durumunda, bazı bakterilerin izotonik NaCl çözeltisi ile teması sonucunda spontan aglütinasyon gösterebileceği için sonuçların değerlendirilmesinden kaçınılmalıdır.

Serbest Koagülaz Testi (Tüp Test) Bu analizde, incelenecek bakteri türünün 18-24 saatlik besiyeri kültüründen alınan 1 ml, taze plazma içeren bir tüpe aktarılır. Daha sonra, tüp 1 saatlik aralıklarla koagülasyon açısından incelenir. Koagülasyon belirtileri bulunamazsa, örnek 18 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek tekrar değerlendirilir. Tüp incelenirken hafifçe eğik tutulmalı fakat çalkalanmamalıdır. Plazmada koagülasyonun gözlemlenmesi, testin pozitif olduğunu gösterir.

İndol, antibiyotik direnci, biyofilm oluşumu ve virülans dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel süreçlerde rol oynayan bakteriler tarafından üretilen bir sinyal molekülüdür.

İndol testinin uygulanışı şu şekilde açıklanmaktadır; Triptofan yönünden zengin bir besiyerinde bakteri kültürünün 18-20 saat boyunca inkübasyonu gerçekleştirilir. Bu sürecin ardından, Kovac’s reaktifi kullanılacaksa, tüpün iç duvarları boyunca dikkatlice 10-15 damla reaktif yavaşça eklenir. Eğer Ehrlich’s reaktifi tercih ediliyorsa, işleme başlamadan önce 1 ml ksilen eklenerek besiyeri içeriğinin tüpün dibine çökmesi sağlanır. Bu aşamada tüp sallanmaz; çökme işlemi tamamlandıktan sonra Ehrlich’s reaktifi ilave edilir. Her iki durumda da reaktiflerin eklenmesi sonucu oluşan renk değişikliği dikkatle gözlemlenir.

Testi yapılacak saf kültürler steril fizyolojik su veya tampon ile biraz sulandırıldıktan sonra besiyerlerine ekimler yapılır ve tüpler 2-7 gün 37 °C inkübasyonda tutulur. Christensen besiyerine iğne ile inokulasyon yapılır ve yatık yüzeye de iğne sürülür.

Voges-Proskauer (VP) testi: bakterileri glikozu kullanarak fermantasyon yaparak ürettikleri son
ürünlerine göre ayırt etmek amacıyla kullanılır. Bu test, bakterilerin fermantasyon sonucu asetilmetilkarbinol (asetoin) isimli bir bileşik oluşturup oluşturmadığını kontrol eder. Glikozun fermantasyonu sırasında oluşan ana bileşen olan piruvik asit, bakterilerin sahip olduğu farklı enzim sistemlerisayesinde çeşitli yollardan işlenir. Bu yollardanbiri, nötr bir tepkimeyle sonlanan ve asetoin olarak da bilinen asetilmetilkarbinol üretimini içerir.