Serolojik ve Moleküler Yöntemler

Sensitivite; bir serolojik testin aranan antikorların varlığını saptayabilme yeteneğinin ölçüsüdür

Spesifite; bir serolojik testin aranan antikorları (veya gerçek pozitifliği) saptamada ne kadar spesifik olduğunun göstergesidir.

Antijen ve antikorun bağlanması sonucu oluşan kompleksi doğrudan ölçen testlerdir. Ancak bu bağlanmayı gösterebilmek veya görselleştirebilmek için radyoizotoplar, floresan boyalar veya enzimler gibi işaretleyicilere ihtiyaç duyulmaktadır.

ELİZA, antikorların veya antijenlerin (proteinlerin) varlığını tespit etmek için kullanılan bir test yöntemidir. Bir antijen veya antikor, özel bir yüzeyde sabitlenir ve daha sonra bir işaretleyici ajan ile işaretlenerek görünür hâle getirilir. Bu yöntem, birçok enfeksiyöz hastalığın teşhisinde ve aşıların etkinliğinin değerlendirilmesinde kullanılmaktadır.

Sıklıkla kullanılan dört tipi bulunmaktadır: Direk ELİZA, Sandiviç ELİZA, İndirek ELİZA, Yarışmalı ELİZA.

Konjugat: Enzim ile işaretlenmiş antikorlara denir (Ör: alkalen fosfataz (AP), horseradish peroksidaz (HRP) vb.).

Substrat: Konjugatın yapısındaki enzim ile reaksiyona giren reaktiftir. Örneğin; p-nitro fenol fosfat, alkalin fosfataz tarafından inorganik fosfata hidrolize edilir ve sarı renkli p-nitro fenol oluşur.

Epitop: Bir antijenin bağışıklık sistemi tarafından, özellikle antikorlar (B hücreleri veya T hücreleri) tarafından tanınan, antijenik determinant olarak da bilinen kısmıdır.

İkincil bağlanma testlerinde, öncelikle birbirine özgül antijen-antikor bağlanması gerçekleşir ve sonrasında gözle görülebilir bir kompleks oluşur. Aglütinasyon (antijen partiküllerinin kümelenmesi), presipitasyon (çözünür antijenlerin çökelmesi) ve komplement fiksasyon testleri bu testler arasındadır.

• Bu yöntemde, antijenler veya antikorlar, tek boyutlu bir agaroz jeli içinde elektroforetik harekete maruz bırakılır.
• Elektrotlar arasına yerleştirilen agaroz jel üzerinde antijenler ve antikorlar bir elektrik alanı etkisiyle hareket eder ve antijen-antikor kompleksleri oluşturur.
• Bu kompleksler, antijenlerin ve antikorların elektroforetik hareket hızlarına göre belirli bir mesafede çaprazlama çizgileri veya presipitatlar oluşturur.
• Oluşan presipitatların boyutu ve yoğunluğu, antijen-antikor etkileşiminin gücüne ve komplekslerin konsantrasyonuna bağlı olarak değişir.

Çift Difüzyon (Ouchterlony Tekniği): Bu yöntem, antijenlerin veya antikorların bir jel veya agaroz matris içinde difüzyonunu izleyerek çalışır. Ouchterlony tekniğinde, antijen veya antikorlar farklı kuyularda veya oyuklarda yerleştirilir ve ardından bunlar arasındaki difüzyon sonucu oluşan çökelti veya çizgiler gözlemlenir. Bu yöntem, antijenlerin veya antikorların birbiriyle etkileşimini, çapraz reaktiviteyi ve antijen-antikor komplekslerinin oluşumunu belirlemek için kullanılır.

Tek Difüzyon (Mancini Tekniği): Bu yöntemde, antijen veya antikor tek bir matris içine yerleştirilir ve bu matris içindeki difüzyon sonucu oluşan çökelti veya çizgiler ölçülür. Mancini tekniği, antijenlerin veya antikorların konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir.

Radial İmmünodifüzyon (RID): Bu yöntemde, antijen veya antikor, agaroz jel veya farklı bir matris içinde bir kuyucuğa yerleştirilir. Ardından, bu antijen veya antikor etrafında difüzyon sonucu oluşan çaprazlama çizgileri ölçülür ve bu çaprazlama çizgileri ile antijen veya antikor konsantrasyonu arasında bir ilişki kurulur. RID, özellikle antikorların belirlenmesi için kullanılır.

İmmünoelektroforez (IEP): Bu yöntem, antijenlerin veya antikorların elektroforetik hareketi ve immünodifüzyon prensiplerinin birleşimidir. Elektroforez, matris içindeki antijen veya antikorların hareketini sağlar, ardından immünodifüzyon prensiplerine göre çaprazlama çizgileri oluşur. Bu çizgiler, antijen veya antikor konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir.

• İki boyutta elektroforez, öncelikle antijenlerin veya antikorların yatay elektroforezi ve ardından da dikey elektroforezini içerir.
• İlk boyutta, antijenler veya antikorlar, yatay agaroz jeli içinde bir elektrik alanı etkisiyle hareket ettirilir.
• İkinci boyutta, agaroz jelin dikey boyutunda, antijenler veya antikorlar bir jel üzerinde hareket ettirilir.
• Bu yöntem, antijenlerin veya antikorların farklı elektroforetik hızlarını ve net olarak ayrılamayan karmaşık karışımlarını çözmek için kullanılır.
• İki boyutta elektroforez, yüksek çözünürlüklü protein ayrımı için yaygın olarak kullanılmaktadır ve kompleks protein karışımlarının analizi için çoklu boyutta ayrım sağlar.

Üçüncül bağlanma testleri, deney hayvanları, embriyolu yumurta gibi in vivo ortamlarda veya hücre kültürü ortamlarında gerçekleştirilen testlerdir. Burada mikroorganizmaların etkilerine bağlı olarak hayvanlarda hastalık oluşabilir ve/veya ölüme neden olabilir, embriyolu yumurtalar ölebilir ve hücrelerde lizis gerçekleşebilir. Nötralizasyon testleri ve koruma testleri olarak ikiye ayrılmaktadır.

PZR, bir DNA veya RNA parçasının milyonlarca kopyasının hızla üretilmesini sağlayan bir moleküler biyoloji tekniğidir. PZR, temel olarak üç aşamada gerçekleşir: Denatürasyon, primer bağlanma ve primerlerin uzatılması.

Denatürasyon; PZR’nin ilk adımı, hedef DNA’nın çift iplikli yapısının ayrılması veya denatürasyonudur. Bu adımda, PZR karışımı 95°C civarında yüksek bir sıcaklığa ısıtılır. Bu sıcaklık, hidrojen bağlarını kırarak DNA ipliklerini ayrıştırır ve çift iplikli DNA’yı tek iplikli tek zincirli DNA’ya dönüştürür.

Primerlerin bağlanması; denatürasyon adımının ardından, reaksiyon karışımı soğutulur ve primer adı verilen kısa, spesifik DNA parçaları, hedef DNA dizisine bağlanacakları sıcaklıkta (genellikle 50-60°C) reaksiyona eklenir. Primerler, hedef DNA dizisinin başlangıç ve bitiş bölgelerine uygun olarak tasarlanmaktadır. Bu adım, primerlerin hedef DNA’ya bağlanması için primerin tam olarak hedef dizinin karşısına gelmesini sağlar.

Polimerize Zincir Reaksiyonu ve Real-time PZR’ın kullanım alanları:

• Köpeklerde parvovirus enfeksiyonu
• Kedilerde panlökopeni virüsü (FPV) enfeksiyonu
• At ve diğer hayvanlarda Streptococcus equi enfeksiyonu (kuduz)
• Avian influenza (kuş gribi)
• Koyun ve keçilerde Chlamydia abortus enfeksiyonu

Viral Hastalıkların Tanısı:

• Kedi lösemi virüsü (FeLV)
• Kedi immün yetmezlik virüsü (FIV)
• Kuduz virüsü
• Köpek parvovirüsü gibi enfeksiyonların tanısında ve izlenmesinde