VİRUSLARIN ÜRETİLMESİ

• Deney hayvanları
  • Konvansiyonel hayvanlar
  • Spesifik patojen free hayvanlar
  • Germ free hayvanlar
• Embriyolu yumurtalar
• Hücre kültürleri

Tavşan, rat, fare, hamster, civciv ve maymunlar

İntranasal (burun boşluğuna), intratrakeal (trake içine), korneal, konjuktival, oral (ağız yoluyla), subkutan (deri altına), intradermal (deri içi), intravenöz (damar içi), intraperitoneal (periton içi) ve intramuskuler (kas içi)

Embriyolu tavuk yumurtası

Çiçek virusları, influenza virusları ve kanatlı virusları

• Embriyolu yumurtalar ışık kaynağı altında incelenerek hava kesesinin sınırları ve embriyonun bulunduğu bölge kurşun kalemle işaretlenir.
• Ekim yapılacak bölge sırasıyla tentürdiyot ve alkolle dezenfekte edilir.
• Özel delici kullanılarak ekim noktasına iğnenin girebileceği büyüklükte bir delik açılır.
• Uzun uçlu bir iğne ile girilerek embriyonun olmadığı yöne doğru 45° açı ile ilerlenir.
• 0,2 ml virus ekilerek enjektör dikkatlice geri çekilir.
• Kabukta açılmış olan delik parafinle kapatılır ve yumurtalar dik pozisyonda, 35-37 °C’ye ayarlı % 40-70 nemli inkübatörlere kaldırılır.

Direkt olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro şartlarda üretilmesi ile elde edilen kültürler primer hücre kültürü olarak adlandırılır. Bu kültürler virus izolasyon çalışmalarında yüksek duyarlılık sağlar. Hücre kültürü şişelerinde (flask) üretilen hücrelerin üretildiği ortamdan kaldırılarak yeni kültür şişelerine aktarılması ve böylece miktar olarak çoğaltılması subkültür hazırlama (veya pasaj), elde edilen yeni kültürler ise subkültür olarak tanımlanır.

Diploid hücre kültürü

Sonsuz sayıda pasajı yapılabilen ve genetik olarak köken aldığı dokudan tamamen farklılaşmış olan hücre kültürlerine ise devamlı hücre kültürü denir. Devamlı hücre kültürleri primer kültürlerin yaklaşık 70 kez pasajlanmasından sonra elde edilebilir.

Hücre üretme vasatı, hücre çoğalması için gerekli olan amino asitler, vitaminler, mineraller, iz elementler, glukoz vb. maddeleri içeren, steril ve pH’sı dengelenmiş bir izotonik çözeltidir. Hücre üretme vasatlarına gelişmeyi teşvik edici faktör olarak %10 oranında serum ilave edilir. Hücre üretme vasatlarına ayrıca bakteri kontaminasyonlarına karşı antibiyotikler (penisilin 100 UI/ml, streptomisin 100 µg/ml) ve mantar kontaminasyonlarına karşı antimikotikler (mikostatin, 2,5 µg/ml) de ilave edilir.

Tripsin

Dimetilsülfoksit (DMSO), gliserin

Adsorbsiyonlu yöntem ve Adsorbsiyonsuz yöntem

• Kültür şişesindeki hücre üretme vasatı hücrelerin bulunmadığı yüzeyden dökülerek uzaklaştırılır.
• Hücre yüzeyleri hücrelere zarar vermeyecek şekilde PBS ile yıkanır.
• Kültür şişesine hacminin % 1’i oranında viruslu materyal konulur.
• Kültürler 37°C’ye ayarlı inkübatöre kaldırılarak 1 saat inkübe edilir.
• Süre sonunda inokulum otoklav edilmek üzere boşaltılır.
• Hücre yüzeyleri PBS ile yıkanır.
• Kültür şişesine vasat ilave edilerek inkübatöre kaldırılır. Burada kullanılan vasat içerisinde serum bulunmaz veya virusa özgün antikor taşımadığı bilinen fötal dana serumundan çok az miktarda (% 1-2) ilave edilebilir.

• Sitopatojen viruslar
• Proliferatif viruslar
• Sitopatojen olmayan viruslar 

• Hemadsorbsiyon testi
• İmmunoperoksidaz testi
• İmmnunofloresan testi
• İnterferens ve Elektron mikroskobik incelemeler

Virusların çoğaldığı hücrelerde meydana gelen değişikliklerin başlıca nedenleri olarak viral proteinlerin hücresel protein sentezini sekteye uğratması, hücrede virus çoğalmasına bağlı olarak şekillenen toksik etki ve hücre zarında yerleşen viral proteinlerin membran geçirgenliğini bozarak ozmotik basıncı olumsuz yönde etkilemesi sayılabilir.

Bir virusun enfeksiyözite gücünün rakamsal olarak ifade edilmesi o virusun titresi olarak tanımlanır. Enfeksiyözite gücünün tespit edilmesi ise virus titrasyonu olarak adlandırılır. Bir virusun titresi o virus süspansiyonunda bulunan enfektif virus partiküllerinin sayısı ile ilgili bilgi verir.

• Virolojik ve serolojik çalışmalarda kullanılacak virus soylarının standardizasyonu
• Aşı hazırlanmasında virus dozunun ayarlanması
• Virusların identifikasyonunda kullanılan fiziko-kimyasal testlerin değerlendirilmesi
• Virus soylarının saflaştırılması (plak test)

Birçok virus türü hücre kültürlerinde çoğalma sırasında enfekte veya dejenere hücrelerden oluşan üreme odakları şekillendirir. Sınırları belirli olan ve çoğunlukla hücre erimesi, dejenerasyonu veya proliferasyonu ile karakterize olan bu üreme alanları plak olarak tanımlanır. Tek tabakalı (monolayer) hücre kültürlerinde her plak bir enfektif virus partikülü tarafından oluşturulur. Virusların vasat içerisinde serbest yayılımını engelleyen yarı katı bir ortam kullanılarak virus süspansiyonunda bulunan enfektif partiküllerin sayısını belirlemek mümkündür. Bu amaçla öncelikle petri kutularında tek tabakalı hücre kültürü hazırlanır. Virus süspansiyonunun 10 katlı sulandırmaları yapılır ve her sulandırma basamağından 4 adet petri kutusuna ekim yapılır. Hücrelerin üzeri sıvı vasat yerine agaroz veya noble agar içinde hazırlanan yarı katı bir hücre üretme vasatıyla kaplanır. Böylece virus çoğalmasıyla ortaya çıkan yeni nesil virus partiküllerinin kültür ortamında serbestçe yayılımı engellenerek sadece enfekte hücreye komşu olan hücreleri enfekte etmesine olanak tanınır. Bu şekilde virus çoğalma odakları (plak) şekillenir. Testin değerlendirilebilmesi için sağlıklı hücreler genellikle nötral red vb. vital bir boya ile boyanır ve boya almamış alanlar şeklinde ortaya çıkan plaklar sayılarak virusun plak oluşturma ünitesi (POÜ) değeri belirlenir. Pratik olarak her plak alanının tek bir virus partikülü tarafından oluşturulduğu kabul edilerek süspansiyondaki toplam virus partikülü sayısı belirlenmiş olur. Tüm viruslar plak oluşturma özelliğine sahip değildir. Dolayısıyla plak titrasyon testi sadece plak oluşturabilen virusların enfektif güçlerinin tespiti için kullanılır. Plak testin bir diğer kullanım alanı da karışık olan virus izolatlarının veya aynı virusa ait değişik biyotiplerin saflaştırılmasıdır.