Ünite 3: Spermanın Saklanması ve Eritilmesi

Giriş

Spermatozoonun yapısı baş, orta ve kuyruk olmak üzere üç ana bölümden oluşmaktadır. Spermatogenezisin son aşamasında spermatozoon bölünme yeteneğini kaybeder. Spermanın saklanması, genelde spermatozoonun metabolizmasını yavaşlatarak veya durdurarak, hücrenin yaşam süresini uzatmakla olasıdır. Sperma saklama teknolojisi; kriyoprotektan ların bulunması, sulandırıcıların geliştirilmesi ve üreme teknolojisindeki ilerlemelerle birlikte hızlı bir gelişim göstermiştir. Kriyoprotektan; Gliserol, yumurta sarısı proteinleri vb. dondurma işlemi sırasında hücreleri düşük ısıların etkilerinden koruyan maddedir.

Spermanın Saklanması

Günümüzde gamet hücrelerinin saklanması esasına dayanan iki yöntem kullanılmaktadır. Bunlar 5°C ısıda saklama ve dondurma yöntemleridir. Her iki yöntemde de spermanın yaşamsal işlevlerini saklama ısısı, soğutma hızı, sulandırıcının kimyasal bileşenleri ve kullanılan kriyoprotektif maddeler belirler. Sıvı saklama yöntemi spermayı sulandırdıktan sonra 5°C gibi düşük ısılarda saklama esasına dayanan bir yöntemdir. Bu yöntem ile sperma yaşamsal aktivitesini ancak 2-3 gün koruyabilmektedir. Donma yöntemi ise spermanın daha düşük ısılarda saklanması esasına dayanır. Hücreyi soğuk şokunun etkilerinden koruyan kriyoprotektif maddelerle sulandırılan sperma, ampul (etil alkol banyosunda), pellet (–79°C kuru buzda) veya payet (–110°C sıvı azot buharında) yöntemiyle dondurularak –196°C ısıdaki sıvı azot içerisinde saklanır. Payet , Sperma dondurma amacıyla değişik renk ve hacimlerde olan plastik çubuklardır. Üzerinde, içinde sperması bulunan hayvanın adı, kulak numarası, dolum merkezi ve tarihi yazılıdır.

Sperma sulandırıcıları ve bu sulandırıcılarda kullanılan kriyoprotektif maddeler, spermanın eritme sonrası yaşamsal aktivitesini sürdürerek, dölleme yeteneğini koruması üzerine büyük bir etkiye sahiptir. Sperma dondurulmadan önce işlem gördüğü sulandırıcının bileşenleri, donma işlemlerinin başarısını belirler. Kaliteli bir sperma sulandırıcısı; spermatozoitler için gerekli olan enerji gereksinimini karşılamalı, bakteriyel üremeyi kontrol etmeli, spermayı soğuk sokuna karsı korumalı ve ortamın pH değerini dengeleyebilmelidir. Bunların yanı sıra sulandırıcılarda uygun bir ozmotik basınç ve elektrolit denge sağlanması, donma sırasında hücrelerin korunması için zorunludur. Donma sırasında oluşan buz kristallerini hacimce küçültmek ve spermatozoonlara karşı zararlı etkisini en aza indirmek amacı ile çeşitli pH tamponlayıcı maddeler (Tris-sitrik asit, Test, Hepes vb.), düşük molekül ağırlığına sahip hücre zarını geçebilen şekerler (früktoz, glikoz vb.) ve membran koruyucu maddeler (gliserol ve diğer polialkoller, DMSO, amino asitler vb.) kullanılmaktadır. Ayrıca, laktoz, sükroz ve dekstran gibi hücre zarını geçemeyen şekerler, antifriz proteinleri ve membran stabilizatörleri (yumurta sarısı, süt, lipitler ve amino asitler) de sulandırıcılarda kullanılmaktadır.

Spermanın Sulandırılması

Sperma, sulandırılmadan önce gerekli spermatolojik muayenelerden geçirilmelidir. Türe özgü, donmuş veya soğutulmuş sperma kullanılarak yapılan suni tohumlama sonrası kabul edilebilir gebelik için gerekli spermatozoa sayısının (tohumlama dozu) hesaplanması gereklidir. Günümüzde suni tohumlama laboratuarlarında sperma sulandırıcısı olarak yağsız süt, sodyum sitrat-yumurta sarısı, Laiciphos ve Tris kullanılmaktadır. Ülkemizde sperma üretim laboratuvarlarında hazır sulandırıcılar tercih edilmekte, zorunlu hallerde Tris, sodyum sitratyumurta sarısı da kullanılmaktadır. Hazır sulandırıcılar genellikle antibiyotik içermektedir. Laboratuarda hazırlanan sulandırıcılara penisilin, streptomisin vb. antibiyotikler katılarak bakteriyel üremenin önüne geçilir.

Bireye özgü ve ejakülatın kalitesine bağlı olarak taze sperma sulandırma, dondurma ve eritme aşamalarında %20-70 oranında motilitesini kaybeder. Bir inek sürüsünde ilk üç tohumlama sonunda %90’ın üzerinde gebelik elde etmek için, bir tohumlama dozunda <7.000.000 motil spermatozoa olması gerekir. Her payette (tohumlama dozu) toplam spermatozoa sayısı 15.000.000 spermatozoa olacak şekilde sulandırılmalıdır. Böylece %50 motilitesi olan bir payette yaklaşık 7,5 milyon motil spermatozoa olacaktır.

Sulandırıcı çeşidine bağlı olarak tek veya iki aşamalı sulandırma teknikleri kullanılmaktadır. Tek aşamalı sulandırma tekniğinde, kriyoprotektan maddeleri içeren hazır sulandırıcılar kullanılmaktadır. Bu teknikte, spermaya katılacak sulandırıcı miktarı hesaplandıktan sonra, sperma 27-30°C ısıda önce 1/1 oranında sulandırılarak spermanın sulandırıcıya alışımı sağlanır. Bundan 10 dk sonra geriye kalan sulandırıcının yarısı ve 10 dk sonra da geriye kalanı eklenerek 1-2 saat içinde 5°C ısıya soğutulur. Sperma 27-30°C ısıda yüksek oranda aktiviteye sahiptir.

İki aşamalı sulandırma tekniğinde, sulandırıcıya kriyoprotektan madde katılmadan önce, Sulandırıcı A ve Sulandırıcı B olarak iki bölüme ayrılır. Sulandırıcı A, spermanın ilk sulandırılmasında kullanılır. Sulandırıcı B’ye ise kriyoprotektan katılarak 5°C ısıya soğutulur. Bu teknikte spermaya katılacak toplam sulandırıcı miktarı, Sperma + Sulandırıcı A = Sulandırıcı B olacak şekilde hesaplanır. Sperma 27-30°C ısıda sulandırıcı A ile aşamalı olarak sulandırılır. Daha sonra, buzdolabı içindeki su banyosuna yerleştirilip suya buz kalıpları atılarak 1-2 saat içinde 5°C ısıya soğutulur. Daha sonra sulandırıcı B ile aşamalı olarak, her beş dakikada bir sulandırıcı B’nin toplam miktarının 1/10’u kadar, aşamalı olarak gerçekleştirilir. Sulandırma işlemi yaklaşık 50 dakika içinde tamamlanır. Sulandırılan sperma, sulandırıcıya alışması için 2 saat alışıma (ekilibrasyon; equilibration) bırakılır.

Spermanın Dondurulması

Payetlere çekilmiş sperma, dondurma amacıyla geliştirilmiş taraklara, dizme rampası yardımı ile dizilir. Azot düzeyinden 5 cm yükseklikte (yaklaşık -80 ile 120°C arası) yerleştirilerek azot buharında 7 dakika süre ile dondurulur. Donmuş payetler sıvı azot (–196°C) içine alınır. Günümüzde dondurma işlemi amacıyla programlanabilir dondurma aygıtları da kullanılmaktadır. Bu aygıtlar, spermanın duyarlı olduğu düşük ısılarda geçiş hızının ayarlanabilmesine olanak tanıması bakımından tercih edilmektedir. Dondurulan spermanın, en az 1 hafta sonra 37°C ısıda 30 saniye süreyle eritilerek, eritme sonrası spermatozoa motilitesi (%) ve anormal spermatozoa oranı (%) değerlendirilir. Değerlendirme sonrası tohumlama amacıyla kullanılacak özellikteki payetler geçici stok tankına aktarılır ve en az 1 ay bekletilir. Bu süre sonrasında, spermatolojik muayeneler yinelenerek, kullanıma uygun olan payetler daimi stok tankına aktarılır. Buradan da saha konteynerine aktarılmak üzere dağıtım tanklarına konulur.

Sperması başarılı bir şekilde donmayan türlerde, dondurma için gerekli alet ve donatının olmadığı durumlarda, değerli damızlıklardan daha fazla yararlanmak amacıyla, sperma 2-3 gün kısa süreli saklanır. Bu uygulama ancak kızgınlıkları uyarılmış veya doğal kızgınlık döneminde olan sürülerin tohumlanmasında kullanılabilir. Bu amaçla, yağsız UHT (ultra high temperature; çok yüksek ısı) süt veya içinde kriyoprotektan bulunmayan sulandırıcılar kullanılabilir. Spermaya katılacak sulandırıcı miktarı hesaplandıktan sonra, sperma 27-30°C ısıda önce 1/1 oranında sulandırılarak spermanın sulandırıcıya alışımı sağlanır ve 10 dk sonra geriye kalan sulandırıcının yarısı ve 10 dk sonra da diğer yarısı eklenerek 1-2 saat içinde 5°C ısıya soğutulur. Sperma, kullanılıncaya kadar, buzdolabı koşullarında saklanır. Soğutulan spermanın dölleme yeteneğinde zamanla düşüklükler şekillenir, ancak, genelde 2-3 gün boyunca tohumlama amacıyla kullanılabilir.

Konteyner Kullanımı ve Spermaya Yapılan Uygulamalar

Donmuş sperma kullanımında ortaya çıkan fertilite sorunlarının çoğu, suni tohumlamayı yapan uygulayıcının, saklama ve uygulama koşullarındaki teknik hatalarından kaynaklanmaktadır. Seri üretime uygunluğu, saklama kolaylığı, yüksek gebelik oranları gibi birçok avantaja sahip olmasından dolayı, payet yöntemi ile dondurma tekniği tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır. Payet yöntemine göre dondurulan sperma, donma aşamasından eritme veya suni tohumlama zamanına kadar, çok sayıda farklı uygulamaya bağlı olarak, değişik aşamalarda ısı yükselmesine maruz kalır. Buna bağlı olarak payetlerin iç ısısı, payetlerin saha konteynerine aktarılması, payetler alınırken kanisterin kaldırıldığı yükseklik, payet alınırken geçen süre, konteyner içindeki azot miktarı, bu uygulamalar sırasında geçen süre ve yineleme sayısına bağlı olarak değişim gösterebilir.

Suni tohumlama konteyneri saha konteyneri, azot tankı vb. olarak da adlandırılır. Konteyner, sıvı azot haznesi (asıl tank), kanister, konteyner kapağı olmak üzere üç bölümden oluşur. Konteyner iç içe olan iki kaptan oluşur. İç ve dış kaplar sadece boyun kısmından birbirine temas halindedir. Bu iki kap arasındaki boşluk vakumlanarak konteynerin izolasyonu artırılmıştır. Bu bakımdan konteynerin boyun bölümü çarpma, devrilme vb. etkenlere bağlı olarak kırılma ve çatlamalara karsı çok duyarlıdır. Konteyner kullanımı sırasında, konteynerdeki azot hareket ederek konteynerin boyun kısmında çatlamalara yol açabileceğinden, konteynerin eğilmesi ve sallanmasından kaçınılmadır. Ayrıca konteynere azot ikmali yapılırken, konteynerde bulunan payetlerin ısınmasına yol açabilecek yüksek miktarda ısınmış azot buharının kap içinde birikmesine izin verilmemelidir. Konteyner kullanılmadığı zamanlarda, azot kaybını ve çevreden köken alan mikroorganizmaların bulaşmasını engellemek için, konteynerin ağzı sürekli kapalı tutulmalıdır. Sıvı azot çok sayıda mikroorganizmayı içerebileceğinden, rutin olarak konteyner temizliği yapılmalıdır. Konteynerdeki azot miktarı ölçüm cetveli aracılığı ile sürekli olarak kontrol edilmelidir. Bunun için ölçüm cetveli konteynere daldırılarak kaynama/buharlaşma durana kadar beklenir. Daha sonra cetvel azotun içinden alınarak havada birkaç kez sallanarak karlanmanın bittiği noktadaki değer okunur. Azot miktarında düşüş olması durumunda en kısa sürede tamamlanmalıdır. Eğer konteynerde bir hata söz konusu ise sperma hemen başka bir konteynere aktarılmalıdır. Konteynerin iç ısısı –120°C ve üzerine çıkmadığı sürece spermanın fertilitesi etkilenmez.

Payetler, hacimlerine göre fazla yüzey alanına sahip olmaları nedeniyle, ısı değişimlerine daha duyarlıdırlar. – 196°C ısıda saklanan spermanın herhangi bir nedenden dolayı –100°C sıcaklığa ısınmasıyla spermatozoonlardaki buz kristallerinin yapısı etkilenir ve ısının yine –196°C dolaylarına indirilmesiyle kristalleşme olayı bir kez daha şekillenir (mikrotorik rekristalizasyon). Bu termodinamik olaylar –130°C ısıda bile oluşabilir. Konteyner içinde saklanan payetlerin ısı farklılıklarına maruz kalması spermatozoon motilitesini ve sağlam akrozom oranını azaltır. Konteynerdeki azot düzeyine, kanisterin kaldırıldığı yüksekliğe ve bu yükseklikte kaldığı süreye bağlı olarak değişen ölçülerde ısı farklılıkları oluşur ve bunun sonucunda kanisterde bulunan spermanın potansiyel fertilitesi azalır. Veteriner hekimi veya suni tohumlama uygulayacak kişiler, payetleri donma kazanından veya depo konteynerinden saha konteynerine aktarırken, gobletlerin içinin sıvı azot ile dolu olmasına, aktarma işleminin çok kısa sürede gerçekleştirilmesine, payet alınırken kanisterin kaldırıldığı yüksekliğini konteyner ağzı içinde olmasına, payetin kanisterden olabildiğince en kısa sürede alınmasına özen göstermelidirler.

Spermanın Eritilmesi

Spermatozoonların yaşama yetenekleri ve morfolojik bütünlüklerinin korunmasında eritme işleminin ayrı bir yeri ve önemi vardır. Payetlerde dondurulan sperma, payetlerin hacim/yüzey alanı oranının epeyce yüksek olması nedeniyle, ısı değişikliğine karşı oldukça duyarlıdır. Payet yöntemi temelde şok dondurma ve şok eritme temeline dayanır. Spermatozoonlar eritme sırasında ani ısı değişimine çok duyarlıdır.

1. Payetlerin konteynerden alınma süresi,
2. Eritme kabının ısısı,
3. Eritme süresi,
4. Eritme sonrası payetin kurulanması,
5. Tohumlama kateterinin ve çevrenin ısısı,
6. Eritme sonrası tohumlama yapılıncaya kadar geçen süre

gibi eritme anında ve eritme sonrasında birçok etken spermayı olumsuz yönde etkiler.

Yüksek gebelik oranları elde edilmesinde veteriner hekiminin önemli görevleri vardır. Tohumlama için en uygun zamanın belirlenmesi, spermanın kurallara ve tekniğine uygun olarak saklanması, taşınması, eritilmesi ve tohumlama tekniklerinin eksiksiz uygulanması bunlardan bazılarıdır. Donmuş spermanın potansiyel fertilitesinin korunmasından sorumlu olan veteriner hekimler (veya teknisyenler) kendilerine göre pratik ama hatalı uygulamalar edinmekte ve bu hatalı uygulamalar giderek alışkanlıklara dönüsmektedir. Bir teknisyen payeti alırken, goblet içerisinde bulunan ve daha sonra kullanılacak olan payetlerin tekrarlı ısınmalarına izin vermemelidir. Eğer sperma başka konteynere aktarılacaksa, payetler içinde azot bulunan gobletlerle taşınmalıdır. Tohumlama için payet eritileceği zaman, teknisyen eritilmiş payetin dış ortamın ısısından etkilenmesini engellemeli, eritme işlemini hayvanın yanında yapmalıdır. Payet kanisterden alınırken, kanister konteynerin boyun kısmından daha yukarı kaldırılmamalı ve bu yükseklikte 30 sn.den fazla tutulmamalı, payet 10 sn gibi kısa sürede alınıp kanister yine sıvı azot içine daldırmalıdır. Payet alınır alınmaz en kısa sürede eritme kabına aktarılmalıdır. Eğer bu süre içerisinde payet alınamazsa, kanister yine sıvı azot içine daldırılıp en az 5 dakika beklenerek payet alınmaya çalışılmadır. Bu uygulamalar, konteynerin en uygun (optimal) koşullarda dolu olduğu durumlar için geçerdir. Konteynerdeki sıvı azot miktarının 2/3’ten daha az olması bile sperma üzerinde olumsuz etkiler yaratabilir. Payetin üretim merkezinin sulandırma, paketleme ve dondurma süreci spermanın eritme şeklini belirler. Çünkü sperma sulandırıcıları içindeki kriyoprotektif maddenin çeşidi, ambalaj şekli ve dondurma hızı, eritme sonrası sperm morfolojisini etkiler. Saha koşullarında suni tohumlama yapacak veteriner hekimi ve teknisyenlerin, donmuş spermayı eritirken, spermayı sağladıkları dondurma merkezinin eritme yöntemini göz önünde bulundurarak eritme işlemini gerçekleştirmeleri, başarılarını artıracaktır.

Eritme işlemi, spermanın dondurulduğu merkezin önerisi yok ise, rutinde kullanılan 37°C ısıdaki sıcak suda 30 sn.de yapılmalıdır. Payet eritildikten sonra güzelce kurulanmasına özen gösterilmelidir. Suni tohumlama setinde azot tankı, payeti almak için uzun, düz uçlu bir pens, spermayı eritmek için eritme kabı, termometre ve payeti kurulamak için peçete vb. bulunmalıdır. Ayrıca payetin çeşidine uygun (0,25 ml veya 0,5 ml) pistole, payeti kesmek için makas, pistole kılıfı ve rektal muayene eldiveni olmalıdır. Bunların yanında, veteriner hekimlerinin gerekli durumlarda intrauterin (uterus içi) sağaltım amacıyla farklı kateterler ve ilaçlar da bulundurmaları gerekir. Payet 37°C ısıdaki su banyosunda 30 sn.de yöntemine uygun eritildikten sonra sudan alınır ve hemen iyice kurulanır. Sonra koltuk altında ısıtılan pistoleye pamuklu kısmı alta gelecek şekilde yerleştirilir ve diğer ucundan yaklaşık 0,5 cm kesildikten sonra, üzerine pistole kılıfı geçirilir. Bu işlemden sonra suni tohumlama gerçekleştirilir.