Ünite 7: Genetiği Değiştirilmiş Deney Hayvanlarının Yetiştiriciliği ve Sağlığı

Genetiği Değiştirilmiş Deney Hayvanları

Genetiği değiştirilmiş deney hayvanları elde ediliş biçimlerine göre iki temel grup altında ele alınabilir

• Transgenik deney hayvanları
• Hedeflenmiş mutasyona sahip hayvanlar

Transgenik hayvan hücrelerinde yabancı bir DNA’yı taşıyan hayvandır. Genel olarak, başka bir organizmanın DNA’sının tamamlayıcı bir kopyasını içeren haberci (messenger) RNA’nın farklı teknikler kullanılarak hayvanın hücrelerine aktarılması sonucu elde edilirler. Viral vektörlerle gen transferi tekniğinde; aktarılması planlanan genin viral vektörler (taşıyıcılar) aracılığı ile deney hayvanının embriyosuna nakledilmesidir. Böylelikle embriyodan oluşan yavrunun ilgili transgeni taşıması sağlanır. Embriyonal kök hücrelere gen transferi tekniğinde; bir başka hayvandan elde edilen kök hücrelere istenilen gen (transgen) aktarılır. İlgili geni başarılı şekilde taşıyabilen kök hücrelerinden bazıları seçilerek taşıyıcı annenin embriyosuna aktarılır ve embriyo dişi hayvanın (taşıyıcı anne) uterusuna (rahmine) cerrahi yöntemle yerleştirilerek transgenik yavru elde edilir. Spermatozooitlere gen transferi tekniğinde; transferi düşülen gen erkek fareden alınan spermler ile beraber birkaç saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda gen transferi yapılan sperm ile dişiden elde edilen yumurta hücresinin laboratuvar koşullarında döllenmesi sonucu transgenin yumurtanın içerisine girmesi sağlanır. Daha sonra ise bu zigot (döllenmiş yumurta) tekrar taşıyıcı dişi hayvanın uterusuna aktarılarak transgenik yavru elde edilir. Testislere gen transferi tekniğinde; aktarılmak istenen gen özel bir formda hayvanın testislerinin belli bir bölgesine (kapsulalarının altına) mikro enjeksiyon yardımıyla verilir. Böylelikle testislerde olgunlaşmış spermlerin bazılarına transgen aktarılmış olur. Daha sonra bu spermler seçilerek laboratuvar koşullarında fertilize edilir ve elde edilen zigot taşıyıcı anneye aktarılarak transgenik yavru elde edilir. Nükleer transfer teknolojisi ile transgenik hayvan elde edilmesinde; son yıllarda transgenik hayvanlarının üretiminde klonlama teknolojisinden de yararlanılmaktadır. Bunun için aktarılacak gen somatik hücrelere (hayvanın vücudundan elde edilen) elektroporasyon ile aktarılır. Gen transferi yapılmış vücut hücresi dişi yumurta hücresine özel bir yöntem ile transfer edilir. Aktarım sonrası bu yumurtalar aktive edilerek belli bir döneme kadar (blastositik evre) laboratuvar koşullarında olgunlaştırılır. Sonrasında yumurta dişi hayvan uterusuna aktarılarak hem klon hem de transgenik yavru elde edilir. Pronüklear-DNA mikroenjeksiyon tekniğinde ise transgenik hayvan üretiminde yukarda açıklanan çeşitli teknikler geliştirilmiş olmasına rağmen pratikte en yaygın kullanılanı tek hücreli embriyonun (zigot) bir pronükleusuna rekombinant DNA’nın doğrudan mikroenjeksiyon ile verilmesi işlemidir. Daha sonra yumurta dişi hayvan uterusuna aktarılarak transgenik yavru elde edilir.

Hedeflenmiş mutasyona sahip hayvanlar çoğunlukla belirli bir geni susturulmuş olan “Knockout” (Okunuşu: Nakavt) ya da daha az tercih edilen belirli bir geni aktif hale getirilmiş “Knockin” (Okunuşu: Nakin) hayvanlardır. Belirli bir genin hedeflenmiş mutasyonuna sahip bir fare tipik olarak embriyonal kök hücre yöntemi ile oluşturulur.

Bundan dolayı başarı yüzdesi çok düşük zor bir işlemdir. İlk olarak, ilgilenilen gen tanımlanır, hedeflenir ve tam olarak işaretlenir. Sonraki aşamada, ilgilenilen gen bölgesinin mutasyona uğratılmış bir şekli kök hücrelere mikroenjeksiyon veya elektroporasyon yöntemiyle yerleştirilir. Prosedür embriyoların taşıyıcı bir anneye implante edilmesiyle son bulur. Mutasyonlu kök hücrelerden köken alan tüm hücreler mutasyonlu gen taşırken, orijinal embriyo hücrelerinden köken alan hücreler ise normal genlere sahip olacaktır. Sonuçta elde edilen yavrunun bazı hücreleri mutasyonlu gen taşırken diğer kısmı normal genlere sahip olacaklardır. Bu hayvanlara kimerik hayvanlar denir. Eğer mutasyonlu kök hücreler sperm ya da yumurta oluşturacak öncül hücrelere (germ hücresi) dâhil edilirse bu defa da oluşacak bazı gametler mutasyonlu genleri taşıyacaktır. Bu gametler normal farelere implante edilirse doğan yavruların bazıları mutasyona uğratılmış gen için heterozigot (mutant genin bir kopyasına sahip) olacaktır. Heterozigot farelerin birbirleriyle çiftleştirilmesiyle elde edilen yavruların ise ¼’ü homozigot yani mutant geni tamamen bulunduran fareler olacaktır. Nihai olarak ta, elde edilen homozigot fareler kendi aralarında çiftleştirilir ve saf knockout/knockin fare kolonileri elde edilir (Şekil 7.2).

Başta da söylediğimiz gibi, bu fareler de eğer knockout ise belirlenen geni fonksiyonunu yitirmiş, knockin ise belirlenen gen aktif hale getirilmiş olacaktır.

Knockout farenin avantajları arasında; bir genin devre dışı bırakılmasının kesin ve temiz bir yolu olması, ilgili genin ürününün etkileri ilaçlar ya da başka kimyasallar kullanılmadan ve onların olası yan etkileri olmadan ortadan kaldırabilmesi, genlere müdahale, o genin ürününün özellikle davranış üzerine olan etkilerinin belirlenmesinde en etkili yol olması sayılabilir.

Genetiği Değiştirilmiş Deney Hayvanlarına Mahsus Özel Durumlar

Genetiği değiştirilmiş deney hayvanlarının yetiştirilmesi ve sağlığı, diğer bölümlerde bahsi geçen deney hayvanlarına göre önemli farklılıklar içerir. Bu hayvanların sahip olduğu istisnai yapı gereği özel yetiştirme ve bakım koşulları şarttır. Genetiği değiştirilmiş hayvanların çoğaltılması ise zor ve uzmanlık isteyen bir süreçten biri olan. Genotiplendirme, bir türün DNA dizisindeki farklılıkların, biyolojik yöntemler aracılığıyla, aynı türün başka bireylerinin DNA dizileri veya referans bir dizi ile karşılaştırarak tespit edilmesi işlemi olarak tanımlanabilir.

O türün kalıtımla anne ve babasından aldığı alellerin belirlenmesini sağlar. Genetiği değiştirilmiş hayvanlardan elde edilen yavruların spesifik olarak genotiplendirilmesi, verimli bir araştırmanın yapılması ve bir araştırma projesinde yer alan hayvan sayısının azaltılması için kritik önem taşır. Polimeraz Zincir Re aksiyonu (PCR) ile analiz çok az miktarda DNA gerektirdiğinden tercih nedenidir. PCR için DNA kuyruk biyopsileri, kulak dokusu, kıl, kan, fekal (dışkı) veya oral örneklerden elde edilebilir. Genotipin Southern Blot yöntemi ile belirlenmesi için ise daha fazla miktarlarda DNA gereklidir. DNA analizi için kuyruk biyopsisi ile bir fareden doku elde etmek güvenli, etkili ve daha insani bir prosedürdür. Kuyruk biyopsilerinden hazırlanan DNA, Southern Blot veya PCR ile analiz için uygundur. Çalışmanın gerekliliklerine bağlı olarak araştırmacılar kıl, fekal veya oral numuneler gibi cerrahi olmayan veya daha az cerrahi içeren yöntemleri düşünmeye teşvik edilmelidirler.

Genetiği değiştirilmiş hayvanların kullanılması ya da üretilmesi için bir protokol geliştirilmesinde ilk aşama herhangi bir hayvan veya hayvan grubunun normal yaşamın seyrinde yaşayacağı veya deneysel kullanım sonucunda ortaya çıkabilecek hastalık profilini belirlemektir. Genetiği değiştirilmiş bazı hayvanlar kendiliğinden bir hastalık geliştirecek şekilde oluşturulurken, bazıları ise yalnızca hedeflenen hastalığın bazı belirtilerini gösterecek şekilde oluşturulabilir. Genetiği değiştirilmiş hayvanlar bir hastalığın patolojisi ve tedavisi, hastalıkla ilişkili klinik problemler, yaşam süresi ya da yaşlanma gibi geniş bir yelpazede deneysel olarak kullanılırlar.

Genetiği değiştirilmiş bir hayvan geliştirmek için ilgili etik komiteye başvurulurken kullanılacak olan tahmini bir hayvan sayısı belirtilmelidir. Koloniyi başlatacak (kurucu) bir fare belirledikten sonra soyu sürdürmek ve karakterize etmek için 80-100 fare gerekebilir. Bu sayıdaki fareye ulaşabilmek için ise sağlıklı üreyebilen ortalama 5 çift damızlık kullanılması yeterli fenotipik ve genotipik karakterizasyonu sağlayacak yavru elde edilmesini sağlayacaktır.

Genetiği Değiştirilmiş Hayvanların Refahı ve Davranışlarının Değerlendirilmesi

Genetiği değiştirilmiş hayvanlarda idrar yapma düzensizliği önemli sorunlardan biridir. Mutant hayvanlar için mümkün olduğunca destek ve konfor sağlamak önemlidir. Eğer hayvan sesten etkilenen özel bir tür ise kafeslerin bulunduğu ortamın tamamen sesten izole edilmesi, hareketlerini kısıtlayıcı bir durumu olan özel bir model ise yemlikler ve su ulaşabileceği şekilde sunulmalıdır. Genetiği değiştirilmiş hayvanların görevli bakım personeli tarafından belli aralıklarla yakından incelemeleri titizlikle yapılmalıdır. Hayvan bakım personeli genellikle hayvanlardaki sakatlıkları ve anormallikleri keşfederler, bu nedenle ilgili personel bu türden farklılıkları ayırt edebilmek konusunda eğitilmelidirler. Genetiği değiştirilmiş hayvanların, özellikle de farelerin deneysel olarak gün geçtikçe artan kullanımları hayvan sağlığı ve refahının yerinde ve zamanında etkili bir şekilde sağlanması açısından çeşitli zorlukları da beraberinde getirmektedir. Bu sorunların önlemek için günümüzde çoğu kuruluş bireysel olarak havalandırılan kafes (Individually Ventilated Gaging: IVC) sistemleri kullanmaktadır. Birçok kafesi her biri ayrı bir odacıkmış gibi bünyesinde bulunduran bu sistemler oldukça değerli ve önemli olan bu hayvanların sistematik olarak takip edilmesine, kolaylıkla bakılmasına, daha sağlıklı bir ortamda barınmalarına olanak sağlarlar.

Yeni oluşturulmuş bir genetiği değiştirilmiş hayvanın genel sağlık değerlendirmesi vücut kütlesi, vücut sıcaklığı ve pelajın (kürk) görünümü hakkında kısa bir değerlendirme ile başlar. Nörolojik refleksler uzuvların hareketi, göz kırpma ve dokunsal uyarılara yanıt olarak kulak ve bıyık seğirmesi de dâhil olmak üzere değerlendirilmelidir. Genetiği değiştirilmiş hayvanın günlük gözleminde genel aktivite seviyeleri, duruş, kürkün durumu, yaralanmalar veya kendine zarar vermenin varlığı ve kafesin genel durumu hakkında bir değerlendirme yapılmalıdır.

Yeni geliştirilen genetiği değiştirilmiş hayvan türlerinin genel sağlık değerlendirmesi tamamlandıktan sonra vakit kaybetmeden yeterli sayıda hayvan üzerinde onların refahına zarar verebilecek olası duyusal, motor veya motivasyon ile ilgili sorunları değerlendirilmelidir. Daha karmaşık davranışların değerlendirilmesine geçilmeden önce öğrenme ve hafıza, saldırganlık, çiftleşme ve ebeveyn davranışları gibi duyusal ve motor değerlendirmeler tamamlanmalıdır.

Bazı knockout fareler öğrenme, ebeveynlik, çiftleşme veya saldırganlık gibi karmaşık davranışlarla birlikte gözlemlenebilen ve bu davranışların yorumlanmasını zorlaştıran duyusal veya algılama eksikliklerine sahip olabilirler. Örneğin, genetiği değiştirilerek belli bir göz kusuru oluşturulmuş bir fare, labirent testi gibi bir işlem sırasında yapması beklenen görevleri başaramayabilir ve bu kusur göz önünde bulundurularak labirent görevini tamamlamasını sağlayacak ilave ip uçlarının labirente eklenmesi gerekebilir. Görme, görsel yerleştirme testi ve görsel uçurum gibi çeşitli testlerle değerlendirilir. İşitsel yetenekler ya bir tıkırtı-uyum testi ya da bir akustik ürkme testi ile değerlendirilir. Koku alma yeteneği, bir hayvanın kafes yataklarının altında gizlenmiş, aşırı kokulu yiyecekleri (kurabiyeler, fıstık ezmesi, pastırma veya peynir gibi) ne kadar süreyle keşfetmesi gerektiği ya da koku ayrım testleri ile belirlenir. Ağrı duyarlılığı, sıcak bir plakadan pati çekme veya kuyruk çekme testiyle test edilebilir. Bu türden ağrı/acı duyusuyla ilgili testlerden önce transgenik farelerin doku hasarını önlemek için maksimal ağrı eşikleri yerine yavaş tepkiden kaynaklanan ağrı eşikleri belirlenmeli ve seçilen eşik noktadan önceki bir zaman aralığında test sonlandırılmalıdır.

Duyusal yeteneklerin değerlendirilmesinden sonra motor yetenekleri ve hareketlerin koordinasyonu değerlendirilmelidir. Birçok transgenik farede koordinasyon, çiftleşme, lokomosyon gibi aktiviteler etkileyen hareket bozuklukları görülür. Bu tür motor yetersizlikler hareket gerektiren herhangi bir davranışı değerlendirmeyi (bir kola bastırma veya bir labirenti aşma gibi) veya belirli davranışların (saldırganlık, çiftleşme veya ebeveynlik gibi) performansını da etkileyebilir. En yaygın olanları hayvanın araştırma becerisine dayalı testlerdir. Açık alan testi bunlardan biridir ve uygulama olarak basit bir testtir.

Genetiği değiştirilmiş hayvanlar, duygusal tepkilerinde (korku, kaygı ve savunma tepkileri) wild type (normal hayvanlar) hayvanlardan farklı olabilir. Tipik olmayan duygusal reaksiyonlar, deneyler sırasında öğrenme ve hafıza görevlerini ya da çiftleşme, ebeveynlik yapma veya saldırgan davranışların değerlendirilmesini etkileyebilir.

Kapalı bir ortam içerisinde oluşturulmuş açık ve aydınlatılmış alanı bulma/araştırma isteği düşük (veya hiç) anksiyete durumu olarak değerlendirilir. Yüksek derecede ansiyeteye sahip olan fareler muhafazanın duvarının yakınında ya da oldukları yerde durmak şeklinde bir davranış sergilerler.