Ünite 10: Tarımsal Biyoteknoloji

Bitki Biyoteknolojisi ve Bitkilerde Uygulanan Biyoteknolojik Yöntemler

Tarımsal üretimi arttırmanın amacı hızla artan dünya nüfusunun yeterli ve dengeli beslenmesini sağlamaktır. Bu amaçla uzun yıllardır melezleme ve seleksiyon yöntemleri kullanılmış, kontrollü olarak üreme sağlanmış ve zaman içinde kalite ve agronomik özellikler arttırılmıştır. Yeşil Devrim olarak adlandırılan 1945’ li yıllar döneminde klasik ıslah metotlarının kullanılması ile hastalık ve zararlılara dayanıklı, yüksek verimli çeşitlerin geliştirilmesi, kimyasal gübre ve tarım ilaçlarının kullanımının artması ile tarımsal üretim artmıştır. Biyoteknoloji; Rekombinant DNA, nükleik asitlerin hücre veya organellere doğrudan enjekte edilmesini içeren “ in vitro nükleik asit teknikleri” ya da “geleneksel ıslah ve seleksiyon yöntemlerince kullanılmayan teknikler” olup doğal fizyolojik üreme veya rekombinasyon engellerini ortadan kaldıran, sınışandırılmış familyanın ötesinde hücrelerin füzyonu olarak adlandırılmaktadır. Bitkilerde uygulanan biyoteknolojik yöntemler iki grup altında toplanmaktadır.

1. Bitki doku kültürü teknikleri (Bitki hücre, doku, organ ve protoplast kültürü),
2. Genetik mühendisliği (Genetik manipulasyon teknikleri, transgenik bitkiler).

Burada dikkat edilmesi gereken husus, genetik manipulasyon tekniklerinin in vitro kültür teknikleri ile birlikte karşılıklı olarak ilişki halinde olmasıdır. Gen aktarılmış hücre ve/veya dokunun tam bitki oluşturma potansiyeli olmalı ve in vitro kültür teknikleri kullanılarak elde edilmesi gerekmektedir.

Tarımda Biyoteknoloji Kullanım Alanları

Tarımda biyoteknoloji çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Bu alanları aşağıda gösterildiği biçimde özetleyebiliriz;

1. Ekonomik değeri yüksek bitki türlerinin kısa sürede çoğaltılması
2. Ekonomik değeri yüksek olan bazı bitkisel sekonder ürünlerin ve biyokimyasal maddelerin elde edilmesi (örneğin ilaç, morfin, atropin, lezzet ve kalite maddelerinin eldesi)
3. İstenen iki veya daha fazla karakterin tek bir bitkide kısa sürede kombine edilmesi
4. Belirli bir karakterin izole edilmiş gen halinde direkt aktarımı
5. Yüksek verimli bitki varyetelerinin kısa sürede seçimi
6. Besin kalitesini arttırma (yüksek oleik asit veya düşük linolenik asit içeriğine sahip çeşitler, beta karoten/A vitamini içeriği yükseltilmiş çeşitler vb.)
7. Kimya endüstrisi için hammadde üretimi sağlama (sabun ve deterjan yapımı için daha ucuz ham madde sağlayan yüksek laurate asit içeriğine sahip çeşit geliştirme)
8. Etilen sentezinin bloke edilmesiyle olgunlaşmanın geciktirilmesi ve uzun süre dayanma, raf ömrünü arttırma
9. Genetik materyalin uzun süre muhafazası
10. Bozulmuş tarla alanlarının onarılması ve toprak erozyonunun önlenmesi
11. Hastalık, zararlı, herbisit ve ekstrem çevre koşullarına (düşük ve yüksek sıcaklıklar, kuraklık, tuzluluk, kireç, çevre kirliliği vb., dayanıklı bitki seçimi
12. Transgenik hayvanların bioreaktör olarak kullanımı (hayvanların süt, kan vb. kısımlarından ilaç üretimi)
13. Yeni (novel) özelliklere sahip bitkilerin üretilmesi
14. Biyolojik olarak parçalanabilir sentetik plastik üretimi ve topraktaki ağır metallerin giderilmesi

Tarımda Biyoteknoloji Uygulamalarının Olası Dezavantajları

1. Faydalı genler yanında zararlı genler de canlı sistemlere sokulabilir. 2. Aktarılan genler farklı canlılarda önceden tahmin edilemeyen davranışlar gösterebilir. 3. Aktarılan genler kontrol dışı gelişip çoğalabilir ve çevredeki başka canlıları yok edebilir. 4. Besin maddesi üretim zincirlerinin bozulmasına sebep olabilir. 5. Yeni türlerin (zararlı yabancı otların) ortaya çıkması söz konusu olabilir. 6. Geleneksel olarak sürdürülen tarımsal üretim sistemi bozulabilir. 7. Mono kültürlerin artması mümkündür. 8. Kullanılan tarım ilaçlarına dayanıklılığın artması söz konusu olabilir. 9. Tarım sektöründe ekonomik yapı bozulabilir.

Bitki Doku Kültürü Laboratuar Organizasyonu

Doku kültürü laboratuarı kurulmasında en fazla önem verilmesi gereken husus sterilitedir. Kontaminasyondan kaynaklanan kayıplar ekonomik açıdan çok önemlidir. Bu kayıpların oranı %1 ile %50 arasında değişiklik gösterebilir. Rutin temizlik ve aseptik işlemler bu kayıpları %1 den daha az oranlara kadar azaltabilir. İyi organize edilmiş bir laboratuarda bulunması gereken temel bölümleri şu şekilde sıralayabiliriz;

1. Ön hazırlık odası (kullanılan malzemelerin yıkandığı ve saklandığı, besi ortamının hazırlandığı, sterilizasyonun yapıldığı oda).
2. Aseptik işlemlerin yapıldığı transfer odası.
3. İnkübasyon odası (ışık, sıcaklık ve nemin kontrol edildiği kontrollü çevre koşulları altında kültür geliştirme odası) ya da iklim dolapları.
4. Dış ortama alıştırma odaları ve/veya iklim kabinleri ( in vitro’ dan in vivo ’ ya geçişi sağlayan çevresel faktörlerin kontrol edildiği kabinler).
5. Gözlem, deneme ve sonuçların alınıp değerlendirmenin yapıldığı odalar.
6. +4 °C soğukta materyal ve malzeme saklama odaları.
7. Seralar (saksı ve toprakta bitki yetiştirmeye uygun ışık, sıcaklık ve nemin kontrol edildiği modern seralar).

Sterilizasyon Teknikleri

Bitki doku kültürü çalışmaları sırasında temizlik, hijyen ve steril bir çevrenin bulundurulması kısaca sterilizasyon son derece önemlidir. Sterilizasyon (aseptik işlemler), in vitro kültür çalışmalarında kullanılan eksplant, besi ortamı, kültür kapları, kullanılan her türlü araç ve gerecin bütün zararlı mikroorganizmalardan (bakteri, mantar, virüs, afit vb.) çeşitli yöntemler kullanılarak arındırılmasıdır.

Çalışma Alanının Yüzey Sterilizasyonu: Steril koşulların gerekli olduğu tüm çalışmalar, steril hava sirkülasyonu bulunan laminar akışlı kabinlerde yapılır. İki tip steril kabin bulunmaktadır.

Kabin İçersine Yatay Hava Veren Kabinler; Hava kabin üstündeki HEPA filtre sisteminden geçer, arka kısımda bulunan daha hassas filtrelerde steril edilip kabin içine basınçlı bir şekilde yatay olarak verilir. Hava direk olarak çalışanın yüzüne gelir bu yüzden mikroorganizmalarla ilgili çalışmalar için uygun olmayıp doku kültürü çalışmalarında kullanılırlar.

Kabin İçersine Düşey Hava Veren Kabinler; Hava kabin üstündeki filtrelerden geçerek steril edilir basınçlı bir şekilde alt kısma düşey olarak verilir. Hava yukarıdan aşağıya aktığı için çalışanın mikroorganizmalardan etkilenmesi önlenir. Bu nedenle mikroorganizmalarla uğraşan bilim adamları tarafından tercih edilen kabinlerdir.

Kullanılacak Cam Malzeme, Pens ve Bisturi gibi Aletlerin, Ekipman, Kaplar ve Besi Ortamlarının Sterilizasyonu (Isı ile Bozulabilenler, Isı ile Bozulmayanlar)

Kuru Sıcaklık ile Sterilizasyon: Bu metot içersinde yüksek sıcaklık ile yanarak kömür haline gelmeyen cam malzemeler, metal araç ve gereçler veya diğer materyaller için kullanılır.

Nemli Sıcaklık ile (Yüksek Basınç ve Buharda) Sterilizasyon: Bu sterilizasyon tekniği basınç altında buharla çalışan otoklav kullanımını kapsamaktadır. Eğer laboratuarda otoklav bulunmuyor ise evde kullanılan düdüklü tencereler bu amaçla kullanılabilmektedir. Bu yöntemde kağıt, cam, metal malzemeler ve sıvı malzemeler (saf su, besi ortamı vb.) 121°C ‘de 15 lb/in2 buhar basıncında 15 dakika tutularak steril edilir.

Mikrodalga Sterilizasyonu: Doku kültürü çalışmalarında kullanılacak malzemelerin ve besi ortamlarının sterilizasyonunda alternatif bir diğer yöntem olarak mikrodalga sterilizasyonu uygulanabilmektedir.

Etilen Oksit Gazı: Plastik petri kaplar ve plastik sentrifuj tüpleri vb. kaplaryüksek sıcaklıklarda steril edilemezler sadece etilen oksit gazı ile sterilize edilirler.Bu kaplar steril edilerek satılırlar ve ikinci kez steril edilmedikleri için bir kez kullanıldıktan sonra atılırlar.

Alev (Bunsen Beki), Cam Boncuk Sterilizatörü ve Kızılötesi Işınla Çalışan Sterilizatörler ile Yüzey Sterilizasyonu: Kullanılacak aletler (bisturi, pens vb.) kullanımdan önce %70’lik etil alkol içine batırıldıktan sonra bunsen bekinin kullanıldığı alevden geçirilerek yüzey sterilizasyonuna tabi tutulur.

Filtre sterilizasyonu: Bitki doku kültürü besi ortamında kullanılan bazı kimyasal maddeler yüksek sıcaklıklara maruz bırakıldığında özelliklerini muhafaza edemezler. Bu maddelerin oda sıcaklığında çok ince filtreler kullanılarak steril edilmesi zorunludur.

Bitki Materyalinin Sterilizasyonu: Bitki materyalinin yüzey sterilizasyonu, sodyum hipoklorit (NaOCl), kalsiyum hipoklorit (Ca [OCl]2), civa klorür, gümüş nitrat ve hidrojen peroksit sıvı solüsyonları ile başarılı olarak yapılabilir. Birçok laboratuar domestos gibi evlerde kullanılan çamaşır suyunu dezenfektan olarak kullanmaktadır.

Antibiyotikler: Hayvan hücre kültürlerinde rutin olarak kullanılmasına rağmen bitki doku kültürlerinde yaygın olarak kullanılmamaktadır. Antibiyotikler veya onların indirgenmiş ürünleri beklenmedik sonuçlara neden olacak biçimde bitki dokuları tarafından metabolize edilebilir. Genellikle transformasyon sonucunda gen aktarılıp aktarılmadığını tespit etmek amacı ile bitki doku kültürü çalışmalarında kullanılmaktadır.

Besi Ortamı Komponentleri

Bitki doku kültürü besi ortamına ilave edilen; inorganik tuzlar, bitki büyüme regülatörleri, vitaminler, amino asitler ve kompleks organik maddeler, karbonhidratlar, su ve besi ortamının fiziksel durumu özetlenmiştir.

İnorganik Tuzlar: İnorganik tuzlar aynı zamanda makro ve mikro elementler olarak bilinmektir. Normal bir bitkinin gereksinim duyduğu gibi kültüre alınan bitki dokuları da belirli inorganik elementlere sürekli olarak ihtiyaç duymaktadır. Karbon, hidrojen ve oksijen elementlerinden başka nispeten büyük miktarlarda ihtiyaç duyulan temel elementler azot (N), fosfor (P), potasyum (K), kalsiyum (Ca), magnezyum (Mg) ve sülfür (S) olup bunlara makro elementler adı verilmektedir. Besi ortamına ilave edilen azot; nitrat, amonyum veya bu iyonların kombinasyonu şeklinde verilir.

Bitki Büyüme Düzenleyicileri (Hormonlar): Büyüme ve gelişme üzerinde regülatör görevi yapan bileşikler, bitki dokuları içersinde doğal olarak (endojen olarak) meydana gelirler. Genellikle çok düşük konsantrasyonlarda aktif olurlar. Bitki büyüme maddeleri ile benzer fizyolojik aktivitelere sahip sentetik kimyasallar bitki büyüme regülatörleri, bitki büyüme düzenleyicileri veya hormon olarak isimlendirilirler. Bitki büyümesinde etkili olan maddeler şu şekilde sınıflandırılabilir; 1. Oksinler, 2. Sitokininler, 3. Gibberelinler, 4. Etilen, 5. Absisik asit veya dorminsler.

Vitaminler: Vitaminler enzim sisteminde reaksiyonun hızlandırılmasına yardımcı olur ve çok az miktarlarda ihtiyaç duyulurlar. Bazıları sadece tiaminin (vitamin B1) hemen hemen bütün bitki doku kültürlerinde temel vitamin kaynağı olduğunu kabul etsede nikotinik asit (niasin) ve pyrodoksin (B6) vitaminleri de büyümeyi uyarabilirler. Tiamin, tiamin-HCl formunda yaklaşık olarak 0.1-30 mg/l arasında değişen oranlarda besi ortamına ilave edilir.

Amino Asitler ve Kompleks Organik Tamamlayıcılar: Glisin (amino asetik asit) dışında amino asitler genellikle bitki kültürü ortamına ilave edilmezler. Eğer organik azot karışımının gerekli olduğu düşünülürse, besi ortamı kazein hidrolaz veya kazomino asitler tarafından zenginleştirilebilir.

Karbonhidratlar: Bütün besi ortamları karbon ve enerji kaynağı olarak şekerin varlığına gereksinim duyar. Sukroz genellikle 20-45 g/l konsantrasyonlarında ilave edilir.

Su: Kültüre alma işlemleri dahil bütün doku kültürü besi ortamlarının hazırlanmasında kullanılan suyun iki kere distile edilmesi veya minerallerden arındırılmış olması gerekir.

Besi Ortamı Fiziksel Yapısı: Kültürler hücre süspansiyon kültürleri olarak hazırlanmadığı sürece yarı katı ortamlarda geliştirilirler.

Bitki Doku Kültürü Yöntemleri

Bu bölümde tarımsal biyoteknoloji ve bitki ıslahında en sık kullanılan bitki doku kültürü yöntemleri özetlenmiştir. Bitki doku kültüründe yaygın olarak kullanılan yöntemleri on grup altında incelemek mümkündür.

Kallus kültürü: Kallus; sağlıklı bitki hücrelerinin bölünmesi ile oluşan gevşek ve/veya kompakt yapılı hücrelerden meydana gelen organize olmamış şekilsiz dokuların oluşturduğu hücre toplulukları olarak tanımlanmaktadır. Kallus kültürü ise izole edilmiş hücre yığınlarının steril olarak kültüre alınmasıdır. Bitkilerin mekanik yaralanması sonucu (bitki parçasının içten veya üstten yaralanması, mikroorganizma veya böcekler ile veya stres ile) kallus oluşumu başlatılabilmektedir. Kallus dokusunun en belirgin özelliği normal olmayan büyümenin bitki oluşumuna sebep olan embriyoid, kök ve sürgün geliştirme potansiyeline sahip olmasıdır.

Hücre süspansiyon kültürü: Uygun sıvı besi ortamlarında yumuşak ve gevşek dokulu kallus kümelerinin bir çalkalayıcı üzerinde hücreler birbirinden bölünerek ayrılıncaya kadar çalkalanarak elde edilen sıvı kültürlere hücre süspansiyon kültürleri denilmektedir.

Organogenesis: Kültüre alınan bitki dokularından adventif olarak sürgün, kök veya yaprak gibi organların oluşmasıdır. Organogenesis aynı zamanda morfogenesis olarak da adlandırılır. Kallustan kök ve sürgün rejenerasyonu tamamı ile birbirinden bağımsız olarak meydana gelir.

Somatik embriyogenesis: Çiçekli bitkilerin embriyo üretme kapasitesi, döllenmiş yumurtanın gelişmesi ile sınırlı değildir.

Totipotent özelliğe sahip somatik dokulardaki hücreler uygun besi ortamlarında embriyo üretme potansiyeline sahiptir. Somatik embriyogenesis, somatik hücrelerden normal erkek ve dişi gametlerin birleşmesi olmaksızın karakteristik embriyo gelişim evreleri göstererek embriyoya benzer yapıların üretilmesidir.

Meristem kültürü ve mikroçoğaltım: Meristem devamlı olarak bölünme yeteneğine sahip hücrelerin oluşturduğu dokulardır. Bitkilerin büyüme konileri veya büyüme konisi yanında bir kaç yaprak primordiasının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültür edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesine meristem kültürü denir.

Embriyo kültürü: Bitkilerin tohum ve tohum taslaklarından olgunlaşmış veya olgunlaşmamış zigotik embriyoların aseptik olarak izole edilmesi ve optimum koşullar altında gelişmeleri için endosperm koşullarının sağlandığı yapay besi ortamlarında kültüre alınarak tam bitki geliştirilmesi olarak tanımlanmaktadır.

Anter ve mikrospor kültürü: Bitkilerden olgunlaşmamış polenleri (mikrosporları) bulunduran anterlerin tomurcuklardan ayrılarak in vitro steril koşullarda suni besi ortamlarında kültüre alınması ve bunlardan normal kromozom sayısının yarısını taşıyan haploid bitkilerin elde edilmesidir.

Protoplast kültürü: Çok hücreli dokularda bitki hücreleri birbirine hücreler arası bağlarla bağlanırlar. Mekanik olarak veya enzimlerle hücrelerin birbirinden ayrılması ve hücre duvarının uzaklaştırılması sonucu oluşan hücre duvarı olmayan çıplak hücrelere protoplast denir.

Genetik Materyalin In vitro Muhafazası: Yüksek verimli, hastalık ve zararlılara dayanıklı kültür bitki çeşitlerinin geliştirilebilmesi için ıslah programlarında kullanılacak genetik materyalin toplanması ve bunların uygun biçimde muhafaza edilerek gereksinim duyulduğunda kullanıma hazır bekletilmesi gerekir. Bu teknik in vitro olarak gen kaynaklarının muhafazası açısında önemli olup gen ve tohum bankalarına alternatif bir saklama şeklidir. Gen kaynaklarının in vitro muhafazasında günümüzde iki temel yöntem kullanılmaktadır. Bunlar;

1. Bitki materyalinde büyümenin yavaşlatılması veya azaltılması: Bitki kültürlerinin canlı kalabilmelerine izin verdiği oranda kültür ortamının ve kültür koşullarının değiştirilmesi esasına dayanır. Bitki doku kültürlerinin fiziksel veya beslenme koşullarında yapılan sınırlamalarla yarı optimal koşullarda muhafaza edilmesi bu kültürde büyümenin yavaşlamasına neden olmaktadır,
2. Bitki materyalinin soğukta muhafaza edilmesi (krayoprezervasyon): Biyolojik materyalin canlı olarak dakikada birkaç derece, kademe kademe soğutulması daha sonra sıvı azot içinde çok düşük sıcaklıklara (-196 °C) daldırılarak dondurulması esasına dayanmaktadır.

Sekonder Metabolit Üretimi: Bitkiler, birçok maddeyi sentez edebilecek kapasitede bir yapıya sahiptirler. Bitkiler bünyelerinde karbonhidrat, protein, yağ gibi temel insan besin kaynaklarını oluştururken odun, selüloz, zamk ve kauçuk gibi maddelerin üretimlerini de gerçekleştirebilirler. Buna ek olarak başta ilaç sanayi olmak üzere, kimya, besin, kozmetik ve zırai mücadele sektörlerinde ekonomik açıdan çok önemli bazı kimyasal maddelerde yine bitkilerden elde edilebilmektedir. Bu kimyasallara genel olarak sekonder (ikincil) metabolitler adı verilmektedir.

Gen Transfer Yöntemleri

Gen aktarımında kullanılan yöntemler;

1. Dolaylı gen aktarımı: Agrobacterium aracılığıyla gen aktarılması. Bu bakterinin doğal bir özelliği bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması ve T-DNA’nın bitki genomuna nakledilmesidir. Virulent bakterinin bitki genomuyla birleşmesiyle transformasyon sonuçlanır. Bitki genomunda tümöre neden olan genlerle plasmidler yer değiştirir.
2. Doğrudan gen aktarım teknikleri:
   1. Kimyasal yöntem: Polietilen glikol (PEG), polivinil alkol veya kalsiyum fosfat gibi kimyasallar ile protoplastların hücre geçirgenliklerinin arttırılması ve DNA’nın aktarılması ilkesine dayanır.
   2. Elekroprasyon: Protoplastları veya diğer bitki dokularını elektrik akımı etkisinde bırakarak membran stabilitesini kısa süreli bozmak ve oluşan porlardan DNA’nın hücre içine alımını sağlamaktır.
   3. Makro enjeksiyon: Aktarılmak istenen DNA’ yı taşıyan plazmid solüsyonunun fideciklere enjeksiyonu ile gen aktarımı gerçekleştirilir.
   4. Mikro enjeksiyon: Hücrenin istenilen bölmesine DNA’nın en kesin biçimde enjekte edilmesini sağlayan mikroenjeksiyon, kılcal mikropipetler yardımıyla ve mikroskop altında doğrudan protoplast, izole edilmiş hücre, zigotik ve somatik hücre vb. yapıların çekirdeğine DNA’nın aktarılması ile gerçekleştirilmektedir.
   5. Biyolistik (partikül tabancası veya bombardımanı): Yüksek derecede hızlandırılmış mikrotaşıyıcı adı verilen 1-2 µ çapındaki metal partiküller aracılığla, bir ateşleme mekanizmasından yaralanarak DNA’nın hedef dokulara aktarılmasıdır. Burada önemli olan kriter, seçilen hücrenin veya dokunun transformasyona uygun olması ve gen aktarımından sonra tam bir bitki rejenerasyon potansiyeline sahip olmasıdır.