Ünite 10: Moleküler Genetik Tekniklerin Kullanımı

Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), DNA dizilerinin invitro olarak çoğaltılması demektir. PCR tüm bir genom yerine, sadece genom üzerinde seçilen bir DNA bölgesinin çoğaltılmasını sağlamaktadır. Bu işleme yükseltgenme denilmektedir. PCR için gerekli olanlar sırasıyla aşağıda listelenmiştir:

• Kalıp adı verilen DNA molekülünün bulunması gerekir.
• Kalıp DNA üzerindeki istenilen bölgeye özgü ileri ve geri yönlü bir çift primer kullanılmaktadır. Primerler yükseltgenilmesi istenilen diziye komplementer, yapay olarak sentezletilen, 15-30 bazlık oligonükleotit dizileridir.
• Yeni dizilerin sentezlenmesini sağlayacak DNA polimeraz enzimi gereklidir.
• Yeni bir DNA’nın sentezlenebilmesi için polimeraz enzimi tarafından primerlerin ucuna eklenecek serbest nükleotidler gereklidir.
• Gerekli olan ısı işlemlerinin düzenli bir döngü içerisinde kısa bir sürede yapılabilmesi için bir PCR cihazı gereklidir.

PCR Aşamaları

PCR’ın ilk aşamasında kalıp DNA’nın birkaç dakika süresince 90 OC’de tutularak zincirlerin birbirinden ayrılması gerekmektedir. Tek zincirli hale getirme işleminin ardından sıcaklık 50-60 OC civarına düşürülerek, primerlerin kalıp DNA üzerindeki komplementer dizilerine bağlanması sağlanmaktadır (S:164, Şekil 10.1). Sonraki aşamada sıcaklık yaklaşık 70 OC de tutularak ısıya dirençli polimeraz enzimi primerlerin 3’ ucundan yeni bir DNA sentezi uzaması sağlanmaktadır (S:164, Şekil 10.2). Uzama sadece 5’-3’yönünde olmaktadır. Üç aşama sonunda, bir kalıp DNA’daki hedef bölgenin ikiye katlanması sağlanmaktadır. Bu üç farklı sıcaklığın arka arkaya olması bir döngü adını almaktadır ve her döngü sonunda 2’nin katları şeklinde logaritmik bir artış olmaktadır (S:165, Şekil 10.3).

PCR ürünleri genellikle jel elektroforezi yoluyla görüntülenmektedir. Elektroforez işleminde elektrik akımını ileten bir tampon sıvı, katı ortam oluşturmak için kağıt, selüloz asetat, nişasta, agaroz veya poliakrilamid ile doğru akım üretmek için bir güç kaynağı gerekmektedir. Jel elektroforezinde kullanılan kimyasalların polimerizasyonu sırasında por adı verilen gözle görülemeyen gözenekler oluşmaktadır.

Agaroz jel elektroforezi, poliakrilamid jel elektroforezine oranla daha yaygın kullanılmaktadır. Agaroz jel, elektroforez tamponu içerisine konulan agarozun yüksek sıcaklıkta eritilmesi ve ardından 45-50 OC’ye kadar soğutularak jel kasedi içerisine dökülmesi ile hazırlanmaktadır. İşlem sırasında oluşturulan kuyucuklara DNA veya PCR örnekleri yüklenerek, güç kaynağı yardımıyla doğru akım verilmektedir. Eksi yüklü olan DNA molekülleri anottan katoda doğru hareket ettikleri ve küçük moleküller daha hızlı gittiği için örnekler arası ayrım yapılabilmektedir (S:166, Şekil 10.4).

Polimeraz Zincir Reaksiyonunun yaygın bir şekilde kullanılmaya başlamasının ardından PCR’a dayanan ve hayvancılık çalışmalarında belirteç olarak kullanılan yeni teknikler geliştirilmiştir:

Kesilmiş parçacık uzunluk polimorfizmi (RFLP): İstenilen bölgenin PCR’ının ardından restriksiyon endonükleaz enzimleri kullanılarak DNA’nın parçalara ayrılması prensibine dayanmaktadır. Enzimin tanıdığı ve kesim yaptığı bölgedeki baz farklılıklarına göre de kesilip kesilmemeye bağlı olarak farklı uzunlukta DNA parçaları elde edilmektedir. Her enzimin kendine özgü bir tanıma dizisi vardır (S:166, Tablo 10.1).

Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmi (AFLP): Bu teknik üç aşamayı kapsamaktadır. Bunlar; DNA’nın restriksiyon enzimleriyle kesilmesi ve bunu takiben kesilen uçlara özgül dizilerin eklenmesi; bu parçaların PCR ile çoğaltılması ve çoğaltılan parçaların görüntülenmesidir (S:167, Şekil 10.5). Teknik değişken sayılı bitişik tekrar polimorfizmlerine dayalı alellerin ayrımını sağlamaktadır.

Polimorfik DNA’nın rastgele çoğaltılması (RAPD): Bu teknik, yaklaşık 10 nükleotid uzunluğunda çok sayıda primer kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin PCR yoluyla çoğaltılması ve görüntülenmesine dayanmaktadır.

Mikrosatellit analizleri: Mikrosatellitlere kısa ardışık tekrarlar ya da basit dizi tekrarları denilmektedir. Hayvanlarla ilgili çalışmalarda en sık kullanılan belirteçlerden birisi olan mikrosatellitler, eşbaskın (kodominant) kalıtım göstermektedirler. Bu yüzden özellikle ebeveyn belirleme testlerinde, adli olaylarda ve populasyon çalışmalarında sıklıkla tercih edilmektedirler

Tekli nükleotit polimorfizmi (SNP): Genom üzerinde belirli bölgelerde bireyler arasındaki tek bazlık farklılığa dayanan (A,T,G ya da C) polimorfizm türüdür. Bu tek bazlık farklılıklar, bazı hayvanların farklı görünmesinin, hastalıklara dirençli olmasının ya da davranış farklılıkları olmasının sebebi olabilmektedir. Eğer daha önceden bir hastalıkla ya da fenotiple ilişkilendirilmiş olan tek bir SNP’e bakılacaksa ve enzim tanıma bölgesinde değişikliğe neden oluyorsa RFLP ile örnekleri taramak yeterli olmaktadır. Ancak genom düzeyinde bir hastalıkla ya da fenotiple ilgili gen veya genlerin yerleri belirlenmek isteniyorsa ya da ebeveyn testi gibi birden fazla bölgenin karşılaştırılması gerekiyorsa çok sayıda SNP bölgesini tarayıp ilişkilendirmek gerekmektedir. SNP’lerin analizleri, cam, plastik gibi küçük katı bir yüzey üzerine çok sayıda probun belirli noktalara mikroskobik düzeyde tutturulmasıyla elde edilen mikroarray teknolojisiyle yapılmaktadır (S:168, Şekil 10.6). SNP’ler kolay belirlenebildikleri ve düşük mutasyon oranına sahip oldukları için özellikle insanlarda en fazla tercih edilen moleküler belirteçlerdir ve her geçen gün hayvanlarda belirlenen SNP sayısı da katlanarak artmaktadır.

Dizi Analizi: DNA dizi analizi bir DNA parçasının sahip olduğu tüm baz dizilimini ortaya koyduğu için, diğer tekniklere oranla, bireylerin ya da populasyonların farklılaşmasında rol oynayan mutasyonları da daha net bir şekilde ortaya koyabilmektedir. DNA dizi analizi iki metotla yapılabilmektedir. Bunlardan ilki kimyasal kırılma yöntemidir. Bu metot ile hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asit kullanılarak bazlar değişikliğe uğratılmakta ve daha sonra piperidin yardımıyla değişikliğe uğramış nükleotitlerin bulunduğu noktalardan DNA zinciri kırılmaktadır. Dört farklı tüpte farklı nükleotitlerden kırılmış boyları birbirinden farklı DNA parçaları elde edilmektedir. Elde edilen DNA parçacıkları, yüksek çözünürlükte poliakrilamid jel elektroforezi ile küçükten büyüğe doğru ilerleyerek birbirlerinden ayrılmakta ve DNA bantları görünür hale getirilmektedir.

Bir diğer ve daha sık kullanılan dizi analizi tekniği ise ideoksi dizi sonlandırma reaksiyonudur. Reaksiyon sırasında DNA polimeraz tarafından sentezlenen PZR ürününe herhangi bir ddNTP’nin katılması ile 3' pozisyonunda serbest hidroksil grubu olmadığından yeni bir baz eklenemez ve sentez devam etmez (S:169, Şekil 10.7). Bunun sonucu olarak da serbest Hidroksil grubu olmayan A,G,T ve C bazlarına bağlı olarak değişen boylarda PZR ürünleri oluşmaktadır. Bu metotta, kalıp DNA, bir primer, DNA polimeraz, üç işaretlenmemiş dNTP, bir işaretli dNTP ve işaretli dNTP’nin ddNTP formunu içeren 4 ayrı tüp içerisinde dört ayrı PZR reaksiyonu kurulmaktadır. PZR ürünlerinin büyüklüğünün belirlenmesi, yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezinde yapılmaktadır. Aşağıdan yukarıya doğru hızı giderek düşen, baz uzunluğu ise giderek artan bantların hangi ddNTP ile oluşturuldukları belirlenmekte ve 5’3’yönüne doğru olan baz dizilimi okunmaktadır. Yeni geliştirilen dideoksi metodunda ise tek tüp içinde dört dNTP’de reaksiyona katılmakta ve farklı renk floresan boyayla işaretlenmiş ddNTP’ler de reaksiyona girmektedirler. Bu metoda göre elde edilen pikler, farklı renkleri sayesinde baz dizisinin okunmasını sağlamaktadır (S:169, Şekil 10.8).

Belirteç Yardımcılı Seleksiyon ve Çiftlik Hayvanlarında Kullanımları

Hayvan yetiştiriciliğinde eldeki hayvanlardan olası en üstün verimin alınması için hem genotipin geliştirilmesi hem de çevre şartlarının iyileştirilmesi amacıyla seleksiyon ve bazı birleştirme sistemleri kullanılmaktadır. Seleksiyon, bir populasyon içerisinde istenilen karakterler yönünden üstün verim özellikleri taşıyanlara, taşımayanlara oranla daha fazla üreme fırsatı verilmesidir. Ancak verim düzeylerine bakılarak yapılan seçimin başarılı olabilmesi için o karakterin kalıtım derecesinin (h2 ), yüksek olması gereklidir. Çevre etkisinin fenotipik varyasyon üzerinde büyük payı olduğu karakterlerde yani kalıtım derecesi düşük karakterlerde fenotipe bakarak seçim yapmak hem hatalı hem de zor olmaktadır. Böyle durumlarda, moleküler genetik ile fenotipik verilere dayanan seleksiyonun beraber kullanıldığı seleksiyon modeli olan Belirteç Yardımcılı Seleksiyon kullanılmaktadır.

Belirteç kullanılarak kantitatif karakter lokusunun belirlenmesi analizlerinde, önce bir karakterin bilinen bir genetik belirtece bağlı olup olmadığı araştırılmaktadır. Çünkü, kromozom üzerinde bir gen ile bir genetik belirteç birbirine ne kadar yakın konumdalarsa, sonraki nesillere birlikte aktarılma olasılıkları da o kadar yüksek olmaktadır. Belirteç Yardımcılı Seleksiyon’da, DNA belirteçleri nicel karakterleri kodlayan genlerin yer aldığı kromozom bölgelerini işaret etmektedirler. Bu kromozomal bölgelere Nicel Karakter Lokusları (Quantitative Trait Loci, QTL) adı verilmektedir. Verim karakterleri olarak da ifade edilen bu karakterlerin çoğu, her biri küçük etkilere sahip toplamalı birçok gen tarafından kontrol edilmektedir. Bazı genlerin karakter üzerine etkisi büyük olabilmektedir; böyle lokuslara da major genler adı verilmektedir.

Çiftlik hayvanları içinde en çok QTL çalışması domuzlarla yapılmıştır. Domuzda moleküler düzeyde belirlenen QTL’lerden birisi büyüme ve farklılaşma faktörlerinden olan IGF2 geninin 3. intron bölgesinde 3072. nükleotidde Guanin’den Adenin’e değişimdir ve kas kütlesinde artışa neden olmaktadır (S:171, Şekil 10.10).

Domuzdan sonra en çok QTL belirleme çalışması yapılan tür olan sığırda ise süt üretimi ile ilgili olarak, genetik belirteçlerin kullanımı ile yapılan QTL çalışmalarında rol oynayan bazı lokuslar belirlense de bütün genler hala tam olarak bilinmemektedir. Ancak çiftlik hayvanları ile ilgili olarak belirteç yardımcılı seleksiyon yardımıyla, 14. kromozomun süt verimiyle ilişkili olduğu belirlenmiş ve daha sonra da bu kromozom üzerinde yer alan DGAT1 genindeki bir mutasyonun, 232. amino asit pozisyonunda Lizinden Alanine dönüşüme neden olduğu ve oluşan varyantların süt yağ kompozisyonunu etkilediği ortaya konulmuştur.

Tavuklarda yapılan çalışmalarda da bazı kantitatif karakter lokusları belirlenmiştir. Vücut büyüklüğü ile ilgili olarak cinsiyete bağlı resesif cücelik, sıcağa karşı tolerans sağlayan çıplak boyunluluk, Leukosis virüs enfeksiyonlarına ve Marek hastalığına karşı genetik direncin kontrolü bu kantitatif karakterlerin önemlilerindendir.

Çiftlik hayvanları içinde diğerlerine oranla daha az çalışılan koyunlarda, et kalitesi ile ilgili olarak iki önemli QTL tam olarak aydınlatılmıştır. Bunlardan birisi Texel koyunlarında Myostatin genindeki bir mutasyondur ve kas kütlesinin artışına sebep olmaktadır. Koyunlarda et kalitesi ile ilgili bir diğer QTL de arka bacaklar ve sağrı bölgesindeki kaslarda kas yapısında değişikliğe yol açarak daha fazla et verimine sebep olan Callipyge genidir.

Koyunlarda çoklu doğumla ilişkili 6. kromozomda Boorola mutasyonu; X kromozomu üzerinde bulunan ve homozigot olduğunda infertiliteye neden olan Inverdale genleri verimle ilişkilendirilmiş başlıca QTL’lerdendir.

Çiftlik hayvanlarında belirteçler yardımıyla belirlenmiş birçok QTL bulunmaktadır. Belirteç Yardımcılı Seleksiyon sayesinde gelecekte hayvanlarda seleksiyon ve hastalıkların tedavisi konularında çarpıcı ilerlemeler olacağı düşünülmektedir.

Rekombinant DNA Teknolojisi ve Transgenik Hayvanlar

Rekombinant DNA (rDNA) teknolojisi bir organizmadan diğerine genetik materyal aktarımını kapsayan, bir dizi işlemler bütünüdür. Rekombinant DNA aktarımı sonucu üretilen proteine rekombinant protein, aktarımın yapıldığı organizmaya ise transgenik organizma adı verilmektedir. rDNA birçok yöntemle oluşturulabilmektedir ancak genel olarak aşağıdaki sıra takip edilir:

• Hedef DNA parçasının verici organizmadan elde edilmesi,
• Hedef DNA’nın restriksiyon enzimleriyle kesilmesi,
• Kesilen parçanın farklı bir organizmanın DNA’sı ile birleştirilmesi,
• Oluşan yeni DNA’nın direk olarak ya da vektör aracılığıyla bakteri gibi bir konak hücreye aktarılması (S:173, Şekil 10.11)

Rekombinant DNA teknolojisinde en önemli unsur çift zincirli DNA’nın bazı bölgelerini tanıyarak kesen restriksiyon enzimlerinin ve kırık DNA parçalarının uçlarını birleştiren ligaz enziminin varlığıdır.

Transgenik organizma elde edilmesinde, kesilipyapıştırılan DNA parçasını taşıyan ve aracı olarak kullanılan canlılara vektör adı verilmektedir. Klonlamada; plazmid, faj, virüs ve bakteri olmak üzere başlıca 4 temel vektörden yararlanılmaktadır. Plazmid vektörleri, bazı prokaryotlarda (bakteriler) ve maya, flamentöz mantar, mavi algler gibi ökaryotik organizmalarda bulunmaktadırlar. Plazmidler, çok sayıda, kolay ve ucuz elde edilmeleri, çift iplikçikli, sarmal ve sirküler bir yapıya sahip olmaları, hastalık yapıcı etkiye sahip olmamaları gibi nedenlerle tercih edilmektedirler.

Bakteriyofaj da denilen fajlar ise bakterilerin içerisine giren, üreyen ve genetik taşıyıcı olarak görev yapan virüslerdir. Fajların bazıları bakterinin ölümüne neden olurken bazıları da kendi genomunu bakterinin genomuna aktararak onunla beraber replikasyona uğramaktadırlar.

Rekombinant DNA teknolojisinin yaygın olarak kullanıldığı bir alan olan hayvanlardan rekombinant ürünler elde edilebilmesi için, yine farklı bir genetik materyalin, alıcı bir hayvana aktarılması gerekmektedir ve böyle hayvanlara da transgenik hayvan adı verilmektedir.

Çok miktarda süt üretebilmeleri ve böylece süt üretimi sırasında çok miktarda da rekombinant protein üretmeleri gibi verim özellikleri amacıyla kullanılan transgenik hayvanlara biyoreaktör hayvanlar denilmektedir.

Rekombinant protein eldesine yönelik transgenik hayvan üretiminde en sık kullanılan yöntem mikroenjeksiyondur. Mikroenjeksiyon yoluyla üretilen ve bilinen en meşhur hayvan Dolly’dir. Mikroenjeksiyon yönteminde izlenen temel aşamalar sırasıyla; oositlerin elde edilmesi, oositlerin in-vitro olgunlaştırılması; boğa sperması kullanılarak in-vitro döllenme, döllenmiş yumurtaların (zigotların) santrifüj yoluyla toplanması, erkek pronükleusu içerisine istenilen cam mikropipet yardımıyla enjeksiyonu, embriyoların in-vitro geliştirilmesi, her bir embriyonun taşıyıcı annelere aktarılması, transgenin varlığının yavrularda kontrolüdür.

Biyoreaktör amaçlı üretilen transgenik hayvanların en sık kullanıldığı alan eczacılıkla ilgili kimyasalların üretimidir. Özellikle bazı insan proteinlerinin çiftlik hayvanlarının meme bezi yoluyla, diğer bir deyişle süt içerisinde, rekombinant protein şeklinde hayvanlardan elde edilmesi bazı hastalıkların tedavisinde önemli gelişmeler sağlamıştır (S:174, Tablo 10.2).

Veteriner Genetikte Moleküler Tekniklerin Kullanıldığı Diğer Alanlar

Teknolojinin ve yeni moleküler tekniklerin geliştirilmesi ile Veteriner Genetik alanında da yeni araştırma alanları oluşmuştur. Bunların başlıcaları, filogenetik çalışmalar, kalıtsal hastalıkların belirlenmesi ve populasyonlarda taranması ile ilgili çalışmalardır.

Filogenetik teriminin sözlük anlamı, bir türün ya da yüksek taksonomik grupların soy gelişimi ve evrim geçmişidir. Türler arasındaki ilişkiler, ırkların tarihi ve genetik çeşitlilik çalışmaları ise filogenetik çalışmalardır.

Kalıtsal hastalıklar sonraki nesillere kalıtım yoluyla geçen hastalıklardır. Kromozom ya da genlerdeki mutasyonlar nedeniyle meydana gelmektedirler. Eğer öldürücü etkiye sahip değillerse dölden döle aktarılmaktadırlar. İlgili mutasyonların belirlenmesine yönelik RFLP gibi moleküler tekniklere dayanan testler geliştirilmiştir. Ayrıca kalıtsal hastalıkların mekanizmalarının ve altında yatan gen bozukluğunun belirlenmesi, benzer hastalıkların insanlarda da olması nedeniyle, ayrı bir öneme de sahiptir. Son yıllarda hayvanlarla ilgili adli olaylarda da moleküler teknikler kullanılmaya başlamıştır. Örneğin, bir kan damlasının hangi türe ait olduğu veya bir et ya da kıl örneğinin hangi bireye ait olduğu kolaylıkla belirlenebilmektedir. Bu testlerin temelinde yine polimorfizm yatmaktadır.