Ünite 1: Histolojiye Giriş ve Temel Histoloji Teknikleri

Giriş

Histoloji canlıların yapı taşı olan hücre ve hücreleri birbirine bağlayan unsurları mikroskobik düzeyde inceleyen bir bilim dalıdır. Hücre ve hücreler arası maddenin boyutlarının çok küçük olması bu bilim dalını mikroskop ve mikroskopta incelemeyi sağlayan tekniklerdeki gelişmelere bağımlı hale getirmiştir.

Bu durumda aşağıda verilen ölçü birimlerini gözden geçirmek oldukça önemlidir.

Mikrometre (µm ya da µ) = 106 =10-3 mm =103 nm = 104 Å

Nanometre (nm) = 10-9 m = 10-6 mm = 10-3 µm = 10 Å

Angström (Å)= 10-10 m = 10-7 mm = 10-4µm = 10-1nm

Histoloji Tekniği

Histoloji biliminde rutin analizlerde ışık mikroskobu kullanılırken detaylı incelemelerde ise elektron mikroskopları kullanılır. Histoloji tekniğinde ışığı geçirmeyen doku ve organlardan ışığı geçirebilecek şekilde ince kesitler hazırlanır ve canlıda renksiz olan doku unsurları boyanarak mikroskop altında incelenir. Özetle hücre ve hücrelerin oluşturduğu dokuların yapısal özelliklerinin mikroskop altında incelenebilir hale getirilmesini sağlayan preparat hazırlama yöntemlerine Histoloji Tekniği adı verilir.

Mezenteryum, kurbağa yavrusunun kuyruğu, Hamster’in yanak kesesi ve spermatozoon canlı olarak incelenebilirken cansız olarak incelenecek bir dokuya uygulanması gereken aşamalar farklılıklar gösterebilir. Hücre ve hücrelerarası maddeyi canlılığın sona erdiği andaki yapısal özellikleri ile korumak için yapılan işleme tespit (fikzasyon) denir.

Histoloji laboratuarlarında kullanılan farklı tespit yöntemleri aşağıda yer almaktadır:

Fiziksel tespit: Isıtma veya kurutma ile gerçekleştirilir.

Kimyasal tespit: İncelenecek doku örneklerine kimyasal madde ya da madde karışımlarını uygulayarak yapılan tespit yöntemidir. Perfüzyon ve daldırma tespiti olarak iki şekilde gerçekleştirilir.

Histoloji Tekniğinde Temel Aşamalar

• Materyalin (doku örnekleri) alınması

• Tespit (fikzasyon) ve yıkama

• Suyunu giderme (dehidrasyon)

• Parlatma veya saydamlaştırma

• Emdirme

• Gömme veya bloklama (blokaj)

• Kesme (kesit alma) ve lama yapıştırma

• Boyama ve kapatma.

Materyaller canlıdan anestezi altında biyopsi ile alınır. Daha sonra hücre ve hücrelerarası maddeyi canlılığın sona erdiği andaki yapısal özellikleri ile korumak amacıyla tespit yapılır. Tespit amacı ile ise Formaldehid, Glasiyal, asetik asit, Etil alkol, Merküri klorür, Pikrik asit, Potasyum dikromat, Aseton, Osmiyum tetraoksit, Potasyum permanganat ve Glutaraldehid gibi kimyasal maddeler kullanılır.

Kimyasal Tespit Aşamasında Üzerinde Durulması

Gereken Faktörler

1) Tespit solüsyonunun amaca göre seçimi

2) Tespit solüsyonunun miktarı

3) Tespit solüsyonunun pH’ı

4) Tespit süresi

5) Doku parçasının büyüklüğü

6) Ortam ısısı

7) Tespit solüsyonunun difüzyon gücü

Tespitten sonra su ya da dereceli alkoller ile yıkama yapılarak tespite ait kalıntıların uzaklaştırılması sağlanır. Suyunu giderme işlemi ile dokuların büyük bir bölümünü su oluşturduğu için %50’den başlayarak %100’e kadar dereceli etil alkoller ile dokunun suyu alınır. Dokuları saydam hale getirmek için parlatma yapılır. Suyu giderilmiş ve saydam duruma gelmiş doku parçaları gömme materyali olarak kullanılan parafin veya paraplastın içine emdirilir. Gömme ile doku erimiş parafin içine yerleştirilir. Çevresinde gömme materyali ile birlikte bulunan dokudan çelik bıçaklar ya da disposable bıçaklar aracılığı ile 5-7µ kalınlığında kesitler alınır. Kesitler önce oda sıcaklığında distile suda yüzdürülerek kırışıklıklar açılır, daha sonra 40-45 °C’de %0,1 oranında jelatin içeren distile suda yüzdürülerek açılmayan diğer kırışıklıklarda açılarak kesitler lama çekilir.

Dokuları oluşturan hücreler canlıda renksizdir. Işık mikroskobu ile inceleyebilmek için boyanması gereklidir. Bu nedenle kuruyan ve lama iyice yapışmış olan kesitler tek tek veya özel kaplarda çok sayıda boyamaya alınır. Kesitlerin düzgün bir yüzeyde kuruması sağlanır. Bundan sonra preperatlar ışık mikroskobu ile incelenmeye hazırdır.

Işık mikroskobunda rutin histolojik boyama dışında histokimya, immunhistokimya gibi metodları kullanmak istenildiğinde tespit ve onu takiben kullanılan süreçlerde birtakım farklılıklar gerekir. Bunun nedeni tespit ve doku takibi sırasında dokulardaki bazı madde ve enzimlerin inaktive olmasıdır. Bu nedenle öncelikle dondurma tespiti tercih edilir, tespiti takiben dondurma mikrotomunda kesitler alınır, distile suya alınan kesitler amaç için özel boyalar ile boyanarak doğrudan uygun bir kapatıcı madde ve lamel ile kapatılır.

Preperasyon Hataları ve Artefaktlar

Tespit aşamasında tespitin yeterli olmaması ya da uzun süreli tespite bağlı olarak dokuda büzüşme, sertleşme buna bağlı olarak dokulardan kesit alınamaması, kesitlerin dağılması gibi durumlarla karşılaşılabilir. Saydamlaştırmada doku örnekleri denature olabilir, bu durumda kesitlerde farklı renklerde boyanmaya neden olur. Kısaca, özetlenen tüm bu preperasyon hataları kesitlerde artefaktlara neden olur.

Artefakt, dokularda gerçekte var olmayan ancak histoloji tekniğinde kullanılan temel aşamalar ya da doku takibi sırasında oluşan ve boyanmış preperatlarda görülen istenmeyen oluşumlardır. Artefaktlar aşağıdaki teknikler ile görüntülenerek tanımlanabilir:

TEM Tekniği: Işık mikroskobunda kullanılan temel basamaklar TEM içinde geçerlidir. Ancak daha yüksek büyütme gücü nedeni ile proteinlerin çapraz bağların daha spesifik olması gerekmektedir. Bu amaçla tespit için glutaraldehid, paraformaldehid, osmium tetraoksid, potasyum permanganat’ın tamponlu solüsyonları kullanılır. Bu solusyonlar, sadece yapıyı korumaya değil elektron yoğun boyalar gibi aktivite göstererek elektron demetleri ile dokunun tanınmasına da olanak sağlar.

SEM Tekniği: Örneğin yüzeyini tarayarak üç boyutlu görüntü elde etmeyi sağlayan bir tekniktir. Bunun için örneklerin yüzeyi altın ya da paladyum gibi ağır metallerin ince bir katmanı ile kaplanır.

Dondurma-Kırma Tekniği: Bu teknik membranların iç yüzeylerinin makromoleküler yapısını ortaya koyar. Dondurma aşamasında buz kristallerinin oluşumunu önlemek için kriyoprotektanlar kullanılır. Çok kuvvetli dondurulmuş örnekler çok keskin bıçaklar ile iç ve dış yaprakların moleküler bağlantılarının olduğu bölgeler arasından kırılır. Kırılan yüzey buharlaşmış platin ve karbon ile kaplanır ve elde edilen kopya doku sindirildikten sonra TEM’de incelenir. Bu metod özellikle hücre membranının transmembran proteinlerini incelemek için kullanılır.

Histolojik Kesitlerin Işık Mikroskobunda Değerlendirilmesi

Tübüler yapıların içi boşlukludur (kan damarları, bezlerin boşaltıcı kanalları, sindirim ve solunum yolları gibi) ve lümenleri vardır.

Hücresel, ipliksel ve tübüler yapılar ise doku ve organlarda üç boyutlu yapının parçaları olarak gelişigüzel bir dağılım gösterirler.

Yuvarlak Bir Cismin Kesit Görünümleri: Yuvarlak bir cismin görüntülenmesini Şekil 1.7’de (Sayfa 15) verilmiş olan örnek açık bir şekilde anlatmaktadır. Burada yumurtanın uzunlamasına (a) ve enine (d) düzlemde orta hat boyunca yapılan bir kesitte tam şekil ve ölçüsünü gösteren bir görünüm görülür. Biraz daha kenardan uzunlamasına (b) ve enine (e) alınmış kesitler yumurtanın dış şeklini korumasını sağlar, ancak yumurta sarısı (çekirdek) ve yumurta akı (sitoplazma) tam ve doğru bir dağılımda görülmez. Yumurtadan teğet düzlemde uzunlamasına (c) ve enine (f) alınmış kesitler yumurtanın oval veya küçük bir obje olduğunu yumurta sarısı görülemediğinden çekirdeğin olmadığı imajını yaratabilir.

Tübüler Bir Cismin Teğet Görüntüleri: Histolojik kesitlerde sıklıkla görülen tübüler yapılar en kolay enine kesitlerde tanımlanırlar. Şekil 1.8’de (Sayfa 15) bir kan damarı, kanal veya bezin histolojik yapısı tek katlı epitel ile kaplanmış kıvrımlı bir tüpten enine uzunlamasına ve oblik alınmış kesitlerde açık bir şekilde gözlemlenmektedir.

Histolojide Kullanılan Özel İnceleme Yöntemleri

Otoradyografi: Doku içinde yer alan radyoaktif materyali bir doku kesiti aracılığı ile üzerinde yer alan fotoğraf emülsiyonuna aktaran tekniktir. Bu metod ile DNA’nın sentezi, hücre bölünmesi, hücre tarafından proteinlerin sentez ve salgılanması ile ekstrasellüler matriks hakkında çalışmalar yapılabilmektedir.

Histootoradyografi: X-Işınları yumuşak dokuların incelenmesinin yanısıra kemik gibi sert dokularda da temel maddelerinin araştırılmasında da kullanılmaktadır. Bu teknikte kemik kesiti bir preperat üzerinde fotoğraf filmi ile temas halindeyken X ışınlarına maruz bırakılır. Fotoğraf filmi daha sonra banyo yapılır ve mikroskop ile incelenir.

Histokimya: Histolojik kesitlerde doku ve hücre içindeki organik ve inorganik maddelerin varlığını ve yerleşimini belirleyerek kimyasal yapıyı ortaya koymayı hedefleyen histoloji tekniğidir. İncelenen maddenin dokuda bulunduğu yerde kimyasal olaylar sonucunda renkli bir bileşiğin çöktürülmesi hedeflenir. Çökeltinin durum ve şiddetinin maddenin miktarı hakkında bilgi verebilmesinin yanısıra, mikrospektrofotometrik yöntemlerle daha kesin sayısal veriler elde edilebilir. Bu yöntem ile protein ve aminoasitler, nukleik asit ve nukleoproteinler, karbonhidratlar, lipidler, lipoproteinler, enzim, pigment ve inorganik oluşumlar tespit edilebilir.

İmmunositokimya: İşaretlenmiş antikorlar ile hücre ve doku antijenlerinin gösterilmesini sağlayan tamamen antijen antikor spesifikliğine dayanan bir tekniktir. Şekil 1.11’de (Sayfa 18) Işık mikroskobu düzeyde immunohistokimyasal bir boyama örneği gösterilmiştir.

Hücre ve Doku Kültürü: Hücre ve dokuların organizma dışında yaşatılması ve çoğaltılmasını amaçlayan bir metoddur. Bu teknik ile hücre davranışları gözlemlenebilmektedir. Hücre ve doku kültürü tekniklerinin kullanım alanları:

• Normal ve kanserli hücrelerin metabolizmalarının incelenmesinde,

• İnsan ve hayvanların patogen virüslerinin epidemiyoloji, teşhis, tedavi ve mücadeleleri üzerindeki çalışmalarda,

• Viral araştırmalarda, doğal konakçılar dışında üretilemeyen viruslerin üretilmesinde,

• Sitogenetik araştırmalarda, mitoz bölünme sırasında kromozomların sayı ve şekillerindeki anomalilerin saptanmasında.

• Moleküler biyolojinin güncel metodları ve yeni DNA dizilimlerinin tanımlanmasında.