Ünite 5: Bakteriyolojik Laboratuvar Yöntemleri

Morfolojik Muayene

Bakterilerin morfolojik muayenesi mikroskobik ve makroskobik morfolojilerinin incelenmesine dayanmaktadır.

Mikroskobik Muayene

Lezyonlu bölgelerden hazırlanan boyalı preparatların mikroskobik incelenmesiyle önemli bilgilere basit, hızlı ve ekonomik olarak ulaşılabilir. Bir doku lezyonundan preparat hazırlanırken materyal pens ile sıkıca tutulurken bistüri ile materyalin lezyonlu bölgesinin derin katmanlarından kazıntı örneği alınır. Bu doku kazıntıları temiz bir lam üzerine alınıp, başka bir lam bunları ezmek için kullanılarak ince bir preparat hazırlanır. Sıvı ya da visköz örneklerde steril bir svap kullanılarak örnekleme yapılır ve lam üzerine bu materyal ince bir tabaka oluşturacak şekilde yayılarak preparat hazırlanır. Preparatlar hazırlandıktan sonra daha sonraki işlemler öncesinde kurumaya bırakılır. Preparat fiksasyonunun amacı vejetatif bakterilerin öldürülmesi, onların boyaya geçirgen hale getirilmesi ve materyalim lama sıkıca sabitlenmesini sağlamaktır. Boyama öncesinde lam preparat hazırlanmış kısmı üstte kalacak şekilde bek alevinden 2-3 kez hızlı bir şekilde geçirilerek fikse edilir. Bu aşamada preparatın aşırı ısıtılıp yakılmamasına dikkat edilmelidir. Giemsa boyama yönteminde kurutulmuş preparatlar öncelikle absolut metil alkol içerisinde 3 dakika boyunca fikse edilir (kimyasal fiksasyon) daha sonra kurutularak boyama işlemine geçilir.

Bakterilerin boyutlarının çok küçük olması nedeniyle morfolojilerinin incelenmesinde mikroskoplardan faydalanılmaktadır. Sıvı ve katı besiyerlerinde saf olarak üretilen bakterilerden preparatlar hazırlanarak özel boyalarla boyanarak incelenirler. Bakterilerin büyüklük, morfolojik şekilleri, kenarları, dizilişleri, spor oluşturup oluşturmamaları, granül bulunup bulunmaması varsa bipolar olup olmadığı, boyanma özelliği araştırılır. Bunun dışında, 12-24 saatlik taze sıvı kültürlerden hazırlanan preparatlarda hareket muayenesi yapılarak bakterinin hareketli olup olmadığı belirlenir. Mikroorganizmaları iyi görebilmek ve ayrıntılarını incelemek için birçok genel ve özel boyama yöntemleri ortaya konulmuştur. Bu yöntemler içinde en uygun olanı belirlenerek boyama işlemi yapılır. Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemleri 2 gruba ayrılır. Bunlar basit boyama ve bileşik boyama yöntemleridir. Basit boyamada mikroorganizmalar hakkında kısa süre içinde bilgi edinmek için tek boya solüsyonu kullanılır. Bu amaçla karbol fuksin, Kristal viyole ve metilen mavisi kullanılabilir. Ayrıca mikroorganizmalar yerine zeminin boyandığı negatif boyama yöntemi mevcuttur. Bu basit boyama tekniğinde kapsül ve spiroketler incelenmektedir. Bileşik boyama yöntemleri, birden fazla boyanın uygulandığı boyama yöntemidir. Bileşik boyama yöntemleri gram boyama, Ziehl-Neelsen boyama, kapsül boyama, flagella boyama, spor boyamadır.

Makroskobik Muayene

Bakterilerin makroskobik muayenesinde katı ve sıvı besiyerlerindeki saf kültürlerinin üreme özellikleri dikkate alınmaktadır. Bakterilerin çoğu katı ve sıvı besiyerlerinde aerobik, anaerobik ve mikroaerofilik koşullarda üretilebilmektedir. Uygun sıcaklıklar (çoğunlukla 37°C) ve süreler boyunca uygun bileşimdeki veya zenginleştirilmiş besiyerlerinde inkübe edilen bakteriler gözle görülebilecek büyüklükte koloniler oluştururlar. Bakterilerin katı ortamlarda oluşturduğu kolonilerin morfolojik ve yapısal özellikleri ve büyüklükleri ayrıntılı olarak incelenir. Stereomikroskop ve gözle yapılan muayeneler sonucunda oluşan kolonilerin smooth (S), rough (R), mukoid (M) ve L formları, renkleri, kokuları, hemoliz durumları ve diğer morfolojik özellikleri ayrıntılı olarak gözlenir ve belirlenir. Sıvı besiyerlerinde bakteriler, belirli inkubasyon sürelerini takiben ya homojen bulanıklık oluşturmakta, bazıları üstte pelikül oluştururken bazıları ise dipte tortu, saç benzeri ya da granüllü bir üreme göstermektedir. Üreme şekli besiyerinin bileşimine, inkubasyon sıcaklığı ve süresine ve o bakteri türünün genetik özelliklerine bağlı değişkenlik gösterebilmektedir. Bakteri türleri kendilerine özel renk, koku, büyüklük ve yapıda koloniler meydana getirirler. Bu özellikler hücrenin genetik kontrolü altında şekillenirler. Koloninin büyüklüğü uygun koşullar altında türlere özel bir karakter taşır. Kolonilerin şekli de türlere özel bir durum gösterir. Hastalık olgularından yeni izole edilen suşlara ait koloniler küçük, yuvarlak ve üzerleri düzgün iken, eskimiş veya birçok pasajı yapılmış suşların bazı kolonileri kenarları çentikli, üzerleri pürüzlü ve mat bir görünümdedir. Tipik hücre duvarı oluşturamayan bakteriler katı ortamlarda üstü ve yanları düzensiz, ortası düğmeli ve granüllü koloniler meydana getirirler. Bu koloni tarzı oluşumuna penisilin, kimyasal maddeler, yüksek ozmotik basıncın etkisi bulunmaktadır.

Besiyerleri

Besiyerleri bakterilerin üretilmesinde kullanılan, bakterilerin ihtiyaç gösterdikleri besin maddelerini, kimyasal maddeleri, indikatör maddeleri ve katkı maddelerini içeren katı ve sıvı formdaki ortamlardır. Nazlı üreme özelliğinde olmayan bakterilerin üretilmesinde kullanılan Nutrient Agar gibi besiyerleri temel besiyeri olarak adlandırılır. Bakterilerin, özellikle de nazlı üreme özelliği gösteren streptokoklar gibi bakterilerin üretilmesinde kullanılan kanlı agar gibi kan, serum veya yumurta sarısı ile zenginleştirilmiş besiyerleri zenginleştirilmiş besiyeridir. Belirli bir bakterinin ya da bir grup bakterinin üremesi için selektif hale getirilmiş besiyerleri selektif besiyerleri olarak adlandırılır. Differensiyal (indikatör) besiyerleri ise, bakteri identifikasyonu açısından çok kullanışlı besiyerleridir. Bunun nedeni, besiyerinin içerisindeki indikatör maddelerle bakteri üremesine bağlı olarak meydana gelen biyokimyasal reaksiyonlarla bakterilerin ön identifikasyonu gerçekleştirilebilmesidir.

Besiyerinin Bileşimine Giren Başlıca Maddeler

Agar, besiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştiricidir. Beyin ekstraktı ve kalp ekstraktı streptokoklar, pnömokoklar, meningokoklar, gonokoklar vb. gibi nazlı üreyen patojen bakterilerin üretilmesi için besiyerlerinin bileşimine katılır. Ayrıca Et ekstraktı, karbonhidratlar, maya ekstraktı, pepton, serum, sodyum klorür ve su basiyerine katılmaktadır.

Besiyerlerinin Hazırlanması

Besiyerleri hazırlanırken uygun miktarlarda dehidre besiyeri temiz bir hassas terazi üzerinde tartılır, cam erlene eklenir ve buna uygun hacimde distile su ilave edilir. Her zaman için camda distile edilmiş su kullanılmalıdır, çünkü bu şekilde distile edilmiş su bakteriler için inhibitör olan klor ve ağır metal iyonlarını içermemektedir. Agar içermeyen (sıvı) besiyerleri hafifçe karıştırılmak suretiyle kolaylıkla çözdürülebilirken, agar içeren dehidre besiyerleri en iyi kaynayana kadar cam bir çubukla karıştırılarak veya manyetik karıştırıcılı bir ısıtıcı üzerinde çözdürülmektedir. Dehidre besiyerleri çözdürüldükten sonra çoğunlukla otoklavda 121°C’de 15 dakika süresince sterilize edilir. Bazı besiyerleri bu yüksek sıcaklıkları tolere edemeyen bileşenler içerdiklerinden bunlar 115°C’de 20 dakika boyunca tutularak sterilize edilirler. Otoklavlandıktan sonra agar içeren besiyerleri cam petrilere dökülmeden önce 50°C’ye önceden ayarlanmış su banyolarında soğutulmalıdır. Cam petrilere petrinin üçte birini dolduracak şekilde 15 ml besiyeri dökülmesi yeterlidir.

Teşhis Laboratuvarlarında Kullanılan Başlıca Besiyerleri

Nutrient Buyyon ve Nutrient Agar besiyerleri birçok mikroorganizmanın üretilmesi için uygun kompleks besiyerlerindendir. Kanlı agar bir bakteriyolojik teşhis laboratuvarının en önemli besiyeridir. Bunun nedeni besiyerinin zenginleştirilmiş özelliği nedeniyle nazlı üreme özelliğine sahip bazı bakteriler dahil olmak üzere birçok mikroorganizmanın üremesine olanak sağlaması, ayrıca bu besiyerinin hem etken izolasyonu, hem etken identifikasyonu ve hem de bakterilerin pasajlanması amacıyla kullanılabilmesidir. Bakteriyolojik incelemeler için kanlı agar hazırlanmasında sığır veya koyun kanı en uygun materyaldir. Kan, önemli insan ve hayvan patojenlerine karşı herhangi bir antikora sahip olmayan ve antibakteriyel tedavi uygulanmamış genç hayvanlardan örneklenmelidir. MacConkey agar gram pozitif bakterilerin çoğunu inhibe eden, enterobakterilerin tamamının üremesini destekleyen, ancak diğer gram negatif bakteriler için selektif olarak inhibisyon sağlayan MacConkey agarların kullanılması önerilmektedir. MacConkey agarda üremenin olup olmaması veya karakteri özellikle de enterobakteri ve diğer gram negatif bakterilerin identifikasyonunda önemli bir kriterdir. Besiyerlerinin seçimi amaçlanan muayene yöntemine (izolasyon, identifikasyon, antibiyogram, vb.) göre seçilmelidir.

Bakteri Kültürü

Bakteri kültürü, bakterilerin laboratuvar ortamında, izolasyon, identifikasyon, karakterizasyon, tiplendirme, pasajlama, araştırma ve saklama amacıyla canlı ve cansız katı besiyerleri, sıvı besiyerleri, yarı- katı besiyerleri gibi ortamlarda üretilmesidir. Besiyerine ekimi yapılacak olan örnek bir doku parçası ise bu öncelikle steril bir cam petri içerisine konur. Doku özellikle de lezyonlu bölgenin kenarından bistüri ile dikkatlice kazınır. Bu kazıntılardan bir miktar ekimi gerçekleştirilecek besiyerinin kenarına bırakılır. Eğer ekimi gerçekleştirilecek klinik materyal sıvı ya da yarı-sıvı karakterde ise bu besiyerinin uç kısmına bir steril svap yardımıyla örneklenerek svabı kendi ekseni etrafında çevirerek yayılır. Katı besiyerlerine öze ile ekim yapılırken önce özeler bek alevinde öze ucundaki tel tamamıyle kızarıncaya kadar tutularak ısıtılarak sterilize edilir. Bu ekim yönteminde özeler hem ekimden önce hem de ekim sonunda bek alevinde sterilize edilir ve sırayla kullanılarak birbirine belirli bir açıyla (60-90°’lik) 4 ekim gerçekleştirilir. Katı besiyerlerine öze ile ekimin amacı koloni morfolojisinin gözlenmesi, antibiyotik duyarlılık testleri ve biyokimyasal identifikasyon için bakteri kolonilerinin tek tek ve izole bir şekilde elde edilmesidir. Uygun besiyerine ekimler gerçekleştirdikten sonra inkübasyon süresi ve inkubasyon sıcaklığı yanında besiyerlerinin tutulacağı atmosfer de dikkate alınmalıdır. Bunların belirlenmesi hangi bakteriyel patojenlerin araştırıldığına bağlı olmaktadır. İnkübasyon atmosferi bakteriler için önemlidir. Patojenik bakteriler aerobik atmosferik koşullarda ürerler. Bazı bakteriler obligat (zorunlu) aerob, bazıları ise obligat anaerobtur. Patojenik bakteriler ve çoğu mikroorganizmalar 37 ^o C’de optimal olarak ürerler. Hızlı üreyen mikroorganizmaların çoğu 2448 saat içinde ürerler. Bazı türler ise 4-16 hafta da bile üremektedirler.

Biyokimyasal Testler

Biyokimyasal testler bakterilerin cins ve tür düzeyinde identifikasyonlarında ve tiplendirilmelerinde kullanılan ve bakterilerin sahip oldukları biyolojik özellikleri (enzim aktivitesi, karbonhidratlardan ve diğer maddelerden faydalanma, vb.) test edilmesine dayanan testlerdir.

Karbonhidrat Fermentasyon testi ; mikroorganizmalar çeşitli karbonhidratları parçalayacak enzimlere sahiptirler. Karbonhidratların parçalanması sonucu organik asitler (asetik, butirik, laktik, propionik asit, vb.), nötral ürünler (aseton, asetoin, alkoller, vb.) ve gazlar (CO ₂ , H ₂ , O2 ,CH ₄ ) oluşur. Bakteri türleri oluşan bu son ürünlerdeki farklılıklar yardımıyla bunların identifikasyonları yapılmaktadır. Besiyerinde glukozun parçalanması sonucu asit oluşumu ve indikatörün renginin açılması, gaz oluşumu ise besiyeri içerisine yerleştirilen durham tüpünün üst kısmında gaz birikmesi ile anlaşılır. Durham tüpü, karbonhidrat fermentasyon testlerinde, besiyerinde gaz çıkışının belirlenmesi amacıyla standart test tüpünün içerisine ters (baş aşağı) olarak konulan küçük tüptür.

Oksidasyon-Fermentasyon Testi ; Bazı mikroorganizmalar glukozu aerobik koşullarda (oksidatif karakterde), bazı diğer mikroorganizmalar ise oksijenin bulunmadığı (anaerobik) durumlarda fermente eder (ayrıştırır). Test edilecek bakterilerin taze kültürlerinden (sıvı ya da katı) 2 adet Hugh Leifson besiyerine ekim yapılır. Tüplerden birine ekimin hemen ardından sıvı parafin konur, diğeri ise sadece pamukla kapatılır. Oksidatif bakteriler sadece pamukla kapatılmış tüpte asit oluşturarak tüpün rengini sarı renge çevirir. Fermentatif bakteriler ise her iki tüpte asit oluştururlar (renk değişimi her iki tüpte de görülür). Her iki tüpte de herhangi bir renk değişimi yoksa bakteri glukozu kullanmıyor demektir.

Metil Red Testi ; Metil kırmızısı reaksiyonu besiyerindeki glukozun bakteriler tarafından fermentatif metabolizasyonu sonucu oluşan organik asitlerin ortamın pH’sını düşürdüğünü ortaya koyar. Metil red solüsyonu pH 6.0’da sarı, pH 4.4’ün altında ise kırmızı renk verir. Kırmızı renk oluşumu pozitif, sarı renk oluşumu negatif reaksiyonu gösterir.

Voges-Proskauer Testi ; Bakterilerin bazıları glukozu ayrıştırdıkları zaman nötral ürünler meydana getirir ve bunlar identifikasyonda önemli göreve sahiptir. Ortama alkali ilave edildiğinde asetil metil karbinol okside olur ve diasetil şekillenir. Bu kreatin, arginin veya kreatininle birleşerek kırmızı renk değişimi gerçekleştirir. VP testi ile metil red (MR) testleri ortamlarının aynı olması nedeniyle birlikte uygulanırlar. Genel bir kural olmamakla birlikte MR pozitif olan bakteriler VP negatiftirler (ya da bunun tam tersi). Bunun nedeni, organik asitler fazla oluştuğunda nötral ürünlerin oluşmamasıdır.

Nitrat Redüksiyon Testi ; Bu test mikroorganizmaların nitratları redükte edebilme yeteneğini belirlemede kullanılır. Bazı bakteriler nitratları (NO ₃ ) nitritlere (NO ₂ ) ve hatta daha ileri basamaklara, amonyak (NH ₃ ) ve gaz nitrojene (N ₂ ) kadar ayrıştırabilmektedir. Üremiş mikroorganizmalardan nitratlı sıvı besiyerlerine ekimler yapılıp tüpler (Durham tüpü içeren) 37°C’de 1-5 gün inkübasyona kaldırılır. Tüplerde gaz (N ₂ ) oluşumu denitrifikasyonu gösterir ve pozitif olarak kabul edilir.

İndol Testi ; Bu test bakterilerin bir aminoasit olan triptofanı ayrıştırarak indol meydana getirebilme yeteneğini belirlemek için kullanılır.

Hidrojen Sülfid Testi ; Bu test bakterilerin sülfür içeren bazı aminoasitleri (sistin, sistein, metionin, vb.) veya bileşikleri (sülfatları) ayrıştırarak hidrojen sülfür (H ₂ S) oluşturmalarını saptamak için yapılır.

Katalaz Testi ; Katalaz bir enzim olup genellikle aerobik mikroorganizmalar tarafından oluşturulur. Bu enzim bakteriler için toksik olan hidrojen peroksiti (H ₂ O ₂ ) ayrıştırarak O ₂ ve H ₂ O meydana getirir. Sıvı ve katı besiyerlerinde üremiş bakterilere H ₂ O ₂ ilave edildiğinde oksijenin kabarcıklar halinde çıkması H ₂ O ₂ ’nin ayrışmasını ve dolayısıyla da katalazın varlığını kanıtlar.

Oksidaz Testi ; Bu test bir bakteri hücresinde sitokrom C oksidaz enziminin bulunup bulunmamasına dayanmaktadır. Anaerob bakteriler oksidaz negatiftirler.

Koagulaz Testi ; Test patojenik stafilokokların belirlenmesinde kullanılan enzimatik bir testtir.

Üreaz Testi; Bu test, mikroorganizmaların üreyi hidrolize eden üreaz enzimini saptamak amacıyla yapılır. Karbonik asidin bir diamidi olan ürenin hidrolizasyonu spesifik bir enzim olan üreaz enzimi tarafından katalize edilir. Reaksiyonun sonunda 2 molekül amonyak ve karbondioksit meydana gelir. Testte besiyerinde amonyağın meydana gelmesi ortam pH’sının yükselmesine neden olur. Besiyerinde kırmızı rengin oluşumu pozitif reaksiyona işaret eder.

Bazı besiyerleri ise birden fazla biyokimyasal test içermektedir. Bunlara örnek olarak Kligler’s iron agar, TSI agar ve Lysine iron agar verilebilir. Ayrıca bazı firmaların ürettiği minyatür test kitleri mevcuttur. Bunlar biyokimyasal testlerin miniaturize edildiği şeritler halindedir.