Ünite 2: Bakteriyel Genetik ve Genetik Tabanlı Testler

Bakterilerde DNA ve RNA

DNA

Bakterilerde genetik veya kalıtsal özellikler DNA molekülü tarafından belirlenir. DNA; Adenin ve Timin ile Guanin ve Sitozin purin ve pirimidin bazlarının hidrojen bağlarıyla birbirine bağlanmasıyla meydana gelmekte ve çift sarmal şeklindedir. Tüm bazlar bir deoksiriboz şeker molekülü ile bağlanmıştır ve bu şeker moleküllerinde fosfat bağları bulunur.

Polimerizasyon; DNA molekülünde fosfat bağlarının birbirine alt alta gelen purin ve pirimidin çiftlerini birbirine bağlayarak çoğalması olayına denir.

DNA sarmalında adeninin karşısında timin, guanin karşısında sitozin molekülü bulunur.

RNA

Yapısında deoksiriboz şeker yerine riboz, timin bazı yerine urasil bulunmaktadır. RNA tek zincirli olup transfer RNA ve ribozomal RNA olmak üzere iki özel formu vardır.

Replikasyon : DNA zincirlerinden her birinin bir ana molekül olarak rol oynayarak karşısına uygun olan nükleotid bazlarının yerleşmesi ile kendi eş molekülünün sentezlenmesine denir. Kendi eşini sentezlenmesini sağlayan bir birinden ayrılmış her bir ana DNA zincirine templeyt denir.

Transkripsiyon : DNA kullanılarak RNA sentezlenmesine denir. Replikasyonda kullanılan temel enzim DNA polimeraz enzimidir.

Hata düzeltme (yanlış okumayı bulma) sitemleri : DNA polimerizasyonu veya sentezi sürecinde yanlış nükleotid dizilerinin oluştuğu durumlarda oluşan mutasyonları engellemek için DNA tarafından geliştirilen mekanizmalardır.

Replikasyon

Bakteriyel hücreler tek bir sirküler kromozoma veya DNA’ya ve kromozom dışı plazmid adı verilen çoğu durumda bağımsız DNA moleküllerine sahiptirler.

Bir bakteri türünün tüm üyelerinde bulunan plazmidlere temel plazmidler veya ek kromozomlar adı verilir.

Bir bakteriyel kromozomun replikasyonunun başladığı noktaya oriV denir. Replikasyonun bitiş noktasına ise ter denir. RNA polimeraz enzimi ile üretilen ufak bir RNA parçasıyla her bir sarmalda başlatılan replikasyonu DNA polimeraz III enzimi yürütür. Sonrasında görevi esas polimerizasyondan sorumlu enzim olan DNA polimeraz I devam ettirir ve bu ufak RNA parçası ayrılır. Bu işlemlerden önce denatürasyonun yani DNA sarmalının helikaz enzimi aracılığıyla ayrılmış olması gerekir. İki ayrı DNA molekülünün bakteri hücresi kutuplarına doğru ilerlemesiyle replikasyon sonlanır ve hücre bölünmesi başlar.

Olgun DNA metillenmiş durumdadır. Yeni sentezlenmiş DNA’nın ise sadece bir sarmalı metillenmiş durumdadır. Bu durum DNA molekülünün tekrar replike olmasını önler.

Transkripsiyon ve Translasyon

DNA molekülünden RNA polimeraz enzimi aracılığıyla bir master RNA molekülünün sentezlenmesine transkripsiyon denir.

Transkripsiyon sonucunda bir ulak RNA (mesenger RNA; mRNA) molekülü oluşur bu molekülde köken aldığı DNA parçasındaki genlerin kodladığı proteinlerin hangi proteinler olduğu şifreli durumdadır.

mRNA’da proteinleri veya polipeptidleri oluşturan her bir aminoasit için her üç bazdan oluşan bir genetik kod içeren bölgeler bulunur. Bu genetik koda triplet veya kodon denir.

Her kodon belli tek bir aminoasidi kodlar veya protein sentezini durduran bir dur sinyali oluşturur. 64 adet farklı kodon grubu mevcuttur. Kodon bilgisi her canlı türünde aynı bilgiyi içerir yani evrenseldir. Bakterilerde protein sentezi üniteleri olan ribozom elemanları çökme katsayılarına göre 50S ve 30S komponentleri olmak üzere ikiye alt üniteden oluşur. Tüm ribozomal ünite 70S’dir. Büyük 50S kısmı 23S ve 5S’lik iki RNA molekülü ve 31 farklı polipeptid; ufak parça 16S’lik bir RNA molekülü ve 21 polipeptid içerir. Ribozomlar mRNA’nın spesifik kısımlarına (Ribozom-bağlanma bölgesi; RBS) bağlanır. Translasyon ; 30S alt ünitesinin RBS’ye bağlanması ve bir başlatıcı transfer RNA’nın (tRNA) yanındaki başlangıç kodonu ile ilişkiye girmesiyle olur. Başlangıç kodonu genellikle AUG, bazen GUG, nadiren de CUG olur. Sonrasında 50S alt ünitesi bu başlangıç kompleksine katılır ve translasyon işlemi başlatılır. Her ribozom mRNA boyunca hareket eder ve bir dur kodonuna ulaşınca durur. Durma noktasında bu kodonu tanımlayacak bir tRNA olmadığından translasyon durur ve ribozom mRNA’dan ayrılır.

Translasyon sonunda sentezlenen aminoasitler birbirlerine bağlanarak bakteriye özgün polipeptid moleküllerini oluştururlar. Polipetid zincirleri translasyon sonrasında aktif proteinlere dönüştürülürler.

Bakterilerde Mutasyon

Bakterilerin yapılarında veya özelliklerinde oluşan olağan dışı değişimlere yol açan DNA bozukluklarına mutasyon denir. Mutasyonlar; Nokta mutasyonları, Şartlı mutantlar (kondisyonel mutantlar), büyük DNA parçalarında oluşan değişimlere bağlı varyasyonlar ve rekombinasyon olmak üzere 4’e ayrılır:

Nokta Mutasyonları

DNA dizisi tek bir pozisyonda değişmiş veya değiştirilmiştir. Dizide bir nukleotid bir başkası ile yer değiştirirse buna tek baz yer değiştirmesi denir. Örneğin lösin amino asidini kodlayan UUA kodonunda UUG ve CUA gibi iki alternatif mutasyon durumunda oluşan kodonlar yine aynı amino asidi kodlayacağından mutasyonun hiçbir etkisi gözlenmez. Buna sessiz mutasyon , yeni kodonlara da sinonim kodonlar denir. Diğer nokta mutasyon tipi de tek bir dizi pozisyonundan bir nükleotidin yok olması veya girmesiyle oluşan anlamlı bölge mutasyonu (frame shift mutasyonu)’dur. Bakterinin fonksiyonlarında önemli değişimler gözlenir.

Şartlı Mutantlar (Kondisyonel Mutantlar)

Bakterilerde antibiyotik veya bakteriyofaj dirençliliğini, gerekli metabolitlerin biyosentezini veya karbon kaynaklarının kullanımını etkileyen genlerde meydana gelen mutasyonlardır.

Büyük DNA Parçalarında Oluşan Değişimlere Bağlı

Varyasyonlar

Delesyonlar, bir gen veya birden fazla gen parçası tümüyle yok olmuş varyasyonlardır ve geri dönüşümsüzdür. Delesyona uğramış DNA bölgesinin veya genlerin fonksiyonları tamamen yok olur. DNA’da dış kaynaklı bir DNA parçacığının bir gen içine girmesine insersiyon denir.

Rekombinasyon

İki doğrusal DNA molekülününün rekombinasyon sürecinde bölünen parçalarının yer değiştirerek bir diğeriyle birleşme durumunu ifade eder. Oluşan DNA moleküllerine de rekombinant DNA denir.

Ekstrakromozomal Genetik Elementler ve Yatay Gen Transferi

Ekstrakromozomal DNA veya plazmidler veya bakteriyofaj gibi genetik elementlerin kazanılması veya kaybedilmesi ile de varyasyonlar oluşabilir. Plazmidler ve bakteriyofajlar bakteriler arasında 3 yolla aktarılırlar:

• Transformasyon,
• Konjugasyon
• Trandüksiyon

Transformasyon : Bakterinin ortamdaki çıplak DNA parçaını direkt olarak içine alması ve alınan DNA’nın kodladığı özellikleri kazanmasına denir.

Konjugasyon : Bir verici (donör) bakteriden DNA transferi için gerekli genleri taşıyan bir plazmidin varlığında diğer alıcı bir bakteriye aktarılmasıyla gerçekleşir.

Transdüksiyon : Genetik materyalin faj aracılığıyla aktarımına denir.

Genetik Tabanlı Testler

Mikrobiyolojideki özellikle klinik mikrobiyoloji olarak bilinen infeksiyöz hastalıkların etkeni mikroorganizmaların aranması ve kararkterize edilmesinde kullanılan genetik yöntemler aşağıda sıralanmıştır:

Plazmid Profili

Bu yöntemle bir bakterinin kaç tane ve hangi büyüklükte plazmid içerdiği saptanarak diğer bakteri izolatlarıyla karşılaştırılır. Kısacası bakterilerin bir ön genetik tiplendirilmesi veya genotiplendirilmesi yöntemidir.

Nukleotid Dizileme (DNA dizileme)

DNA’daki nükleotidlerin hangi sırada bulunduklarının saptandığı Nukleotid dizileme , DNA tiplendirmesi veya genotiplendirme açısından en temel metottur. DNA dizilemesi için iki popüler yöntem olan Kesim Yöntemi (Chemical Clevage Method) ve Zincir Sonlandırma Yöntemi (Chain Terminator Method) kullanılır.

Özgün Fragman Uzunluğu Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)

RFLP tekniği, mutasyonlar nedeni ile restriksiyon endonükleaz enzimleri denen DNA’yı kesen özgün enzimlerin DNA’yı spesifik olarak kestiği yerlerde ortaya çıkan nükleotid baz değişimlerini ortaya koyar.

Elektrik Vurumlu Saha Jel Elektroforezi (Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE)

PFGE yöntemi, epidemiyolojik yönden önemli olup, değişik kaynaklı ve farklı coğrafik bölgelerden elde edilen bakteri izolatlarının genetik ilişkilerinin belirlenmesinde kullanılır.

Nükleik Asit Hibridizasyonu

Hibridizasyon, uygulandığı ortama göre solüsyon fazlı hibridizasyon (sıvı ortamların içinde) ve katı fazlı hibridizasyon olmak üzere iki tiptir.

Nükleik Asit Amplifikasyon Teknikleri

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), çok az miktardaki DNA veya RNA molekülünün enzimatik olarak çok fazla miktarda oluşması bir başka deyişle 1-2 kopya DNA’nın milyonlarca kopyaya çoğaltılmasıdır. Bu işleme nükleik asit arttırılması veya amplifikasyonu denir.