Ünite 10: Seroloji

Antijen Antikor Reaksiyonları

Seroloji kan serumunda antikor varlığını/düzeyini inceleyen bir bilim dalıdır. Bu kavram içinde yer alan serolojik testler antijen antikor reaksiyonlarına dayalı teknikleri kapsar. Bilindiği gibi infeksiyöz hastalıklar sonucu konakçıda hastalık etkenlerine spesifik antikor yanıtı oluşur. Antikorlar vücutta en fazla kan serumunda bulunur. Bu nedenle hastalıkların teşhisinde kan serumunda spesifik antikor varlığının/düzeyinin saptanması büyük önem taşır. Bu amaçla çeşitli serolojik testler kullanılmaktadır. Serolojik testler kısa sürede yanıt alınması ve güvenilir olmaları nedeni ile infeksiyöz hastalıkların teşhisinde öncelikle tercih edilen yöntemlerden biridir.

Serolojik testlerin temelini antijen ve antikor molekülleri arasındaki spesifik reaksiyonlar oluşturmaktadır. Testlerin uygulanmasındaki amaca bağlı olarak serum veya antijen sulandırmaları yapılır. Konakçının doku ve vücut sıvılarında infeksiyöz bir hastalık etkeninin saptanması amaçlanıyorsa, antijen sulandırması yapılır ve üzerine uygun miktarda antiserum (antikor) eklenir. Yönteme uygun sıcaklık ve sürede inkübe edilir. İnkübasyon süresi sonunda pozitif reaksiyonun gözlendiği en yüksek antijen sulandırması antijen titresi olarak ifade edilir. Bu durumda bilinmeyen antijen kaynağı konakçının şüpheli kan, doku vb. örnekleridir. Bazı testler, antijen veya serum sulandırma yapılmaksızın direkt bir araya getirilerek uygulanır. Bu durumda serumun veya antijenin titresi belirlenemez ve sonuç “pozitif” veya “negatif” olarak değerlendirilir. Serolojik testler çeşitli amaçlarla kullanılabilmektedir ve bu amaçlar şöyle sıralanabilir:

• İnfeksiyöz hastalıkların tanısı,
• Aşı programlarının düzenlenmesi amacı ile aşılama öncesi maternal antikor düzeyinin belirlenmesi ve aşı uygulamalarından sonra koruyucu bağışıklığın saptanması,
• Humoral immün yetmezliklerin belirlenmesi,
• Vücut dokularında veya kan, lenf vb. vücut sıvılarında antijen varlığının saptanması,
• Antijen ve antikor moleküllerinin tiplendirilmesi.

Serolojik Reaksiyonların İki Basamağı

Serolojik reaksiyonlarda antikor ve antijen molekülü arasındaki bağlanma iki aşamalıdır. İlk aşamada antijen ve spesifik antikor molekülü birbirlerine uygun reseptörler aracılığı ile bağlanırlar. Bu aşama hızlı oluşur, ısıya bağımlı değildir ve geriye dönüşebilir özelliktedir. Çıplak gözle görülemeyen bu döneme “ birincil bağlanma aşaması ” denir. İkinci aşamada ise, birbiri ile spesifik olarak bağlanmış olan antijen-antikor molekülleri bir araya gelerek kümelenir ve bir kompleks oluşturur. Antijen antikor moleküllerinin oluşturdukları bu yapıya lattis (örgü) formasyonu denir. Bu aşama daha yavaş gelişir, ortamda elektrolit bulunması gerekir ve düşük ısılarda daha etkin bir birleşme olur. Oluşan antijenantikor kompleksi bu aşamada kendi ağırlıkları ve elektrolitin etkisi ile çöker. “ İkincil bağlanma aşaması ” olarak tanımlanan bu dönemde antijen antikor molekülünün birbirinden ayrılması mümkün değildir, diğer bir ifade ile bu dönem geriye dönüşebilir özellikte değildir.

Bağlanma Aşamalarına Göre Serolojik Testler

Birincil bağlanma testleri

Antijen antikor reaksiyonlarının birinci bağlanma aşamasını saptar. Diğer bir ifade ile bu aşamada antijen ve antikor molekülleri uygun reseptörleri ile sadece bağlanmışlardır ve henüz kümelenme ve çökme olmamıştır. Bu nedenle birincil bağlanma testlerindeki reaksiyonlar gözle görülemez ve bu reaksiyonların gözle görülebilir hale gelmesi için konjugat kullanılması gerekir. Birincil bağlanma testleri çok düşük konsantrasyonlardaki antijen veya antikorları saptama özelliğine sahip oldukları için duyarlılıkları yüksek testlerdir. Birincil bağlanma testlerinin önemli özelliklerinden bir diğeri ise kullanılan yönteme göre antijen veya antikor moleküllerinin katı yüzeylere yapıştırılması ve reaksiyonların bu katı yüzeylerde oluşturulması, ardından reaksiyona girmeyen fazla antijen ve antikor moleküllerinin yıkanarak uzaklaştırılabilmesidir. Bu testlerin değerlendirilebilmesi için ELISA okuyucusu (spektrofotometre), şuoresan mikroskop vb. alet ve ekipmana gereksinim vardır. Bu testlere örnek olarak ELISA, immunoşuoresan, radyoimmunoassay verilebilir.

• Enzim immünoassay (EIA) : Enzim immunoassay genel bir tanım olup, bu tanım içinde antijen veya antikor moleküllerinin enzim ile işaretlenmesi esasına dayanan ve enzim-substrat ilişkisi ile açığa çıkan reaksiyonların (renk değişikliği) değerlendirildiği testler bulunur. Veteriner hekimlik alanında bu kapsamda kullanılan en önemli ölçüm tekniklerinin başında ELISA (Enzyme Linked İmmunosorbent Assay) gelir. ELISA’da antikor veya antijen moleküllerini işaretlemek için en fazla kullanılan enzimler horseradish peroksidaz, alkalin fosfataz ve bgalaktosidaz’dır. ELISA ile diğer birincil bağlanma testlerinde olduğu gibi antijen veya antikor varlığı veya düzeyi saptanabilir ve bu amaçla farklı teknikler uygulanır.
• İmmunoşuoresan teknikleri : İmmunoşuoresan (IF) teknikleri, antijen veya antikor moleküllerinin şuoresan boyalar ile işaretlenmesi ve oluşan spesifik antijen-antikor reaksiyonlarının ultraviole (UV) ışığı altında şuoresan parlamalar ile gösterilmesi esasına dayanır. IF tekniklerinde şuoresein izotiyosiyanat (FITC) en sık kullanılan şorokrom boyalardır ve reaksiyonlar şuoresan mikroskop altında görülmektedir. IF teknikleri de ELISA’da olduğu gibi antijen veya antikor aramak için farklı yöntemlerle uygulanabilmektedir.
• Radyoimmunoassay (RIA): RIA, antijen veya antikor moleküllerinin radyoizotoplarla işaretlenmesi ve oluşan spesifik antijen-antikor reaksiyonlarının açığa çıkardığı radyoaktivitenin özel cihazlarla (gama-counter) ölçülmesi esasına dayanan teknikleri içerir. Antijen veya antikor moleküllerini işaretlemek için genellikle iyot125, karbon-14 gibi radyoizotoplar kullanılır. RIA antijen veya antikor saptamak amacı ile kullanılmaktadır. Bu tekniklerin başlıca kullanım alanları; vücut sıvılarında düşük düzeylerde bulunan ilaç, hormon, enzim aranması, alerjik bireylerde alerjene spesifik IgE saptanmasıdır. ELISA ve IFA tekniklerine benzer şekilde uygulanan farklı yöntemleri vardır. Diğer primer bağlanma testlerine göre çok daha duyarlı olmasına rağmen, RIA uygulayanlar için radyoaktivite nedeni ile sağlık riskleri taşıması, özel cihazlara gereksinim göstermesi ve maliyetlerinin yüksek olması nedeni ile günümüzde özel araştırma laboratuvarları dışında fazla tercih edilmemektedir.

İkincil bağlanma testleri

İkincil bağlanma testleri, antijen-antikor reaksiyonlarının ikinci bağlanma aşamasını ortaya koyan testlerdir. Daha önce de bildirildiği gibi, bu aşamada birbirine spesifik olarak bağlanmış antijen ve antikor molekülü ağ veya örgü tarzında birleşerek erimeyen immün kompleksler oluştururlar. İkinci aşamanın oluşabilmesi için antijen ve antikor konsantrasyonunun da uygun (optimal) olması gerekir. Bu nedenle ikincil bağlanma testleri birincil bağlanma testlerine oranla daha az duyarlıdırlar. Buna karşın oluşan reaksiyonların çıplak gözle görülebilmesi, işaretleme teknikleri gibi özel uygulamalara gereksinim göstermemesi nedeni ile laboratuvarlarda daha kolaylıkla uygulanabilmektedirler. Bu testlere örnek olarak aglütinasyon, presipitasyon, komplement fikzasyon vb. verilebilir.

• Presipitasyon: İkincil bağlanma testlerinde, eriyebilir özellikte olan antijenler ile homolog antiserumun bir araya gelmesi ile oluşan reaksiyonlara “presipitasyon” adı verilir. Eriyebilir özellikteki antijenlere “presipitinojen ve bunlar ile reaksiyona giren spesifik antikorlara ise “presipitin” denir. IgG, IgM ve IgA presipitasyon reaksiyonlarına katılan immunglobulinlerdir. Ancak IgG en güçlü presipitindir. Serum proteinleri ve bakteriyel polisakkarit yapılar en önemli presipitinojenlerdir. Presipitin ve presipitinojen uygun koşullarda bir araya getirildiğinde ilk birkaç dakika içinde bir bulanıklık oluşur, bu birleşme dönemidir. Birkaç saat içinde ise antijen-antikor kompleksi oluşur ve tüpün dibine çöker. Antijen-antikor kompleksine “presipitat” denir. Presipitasyon testleri sıvı veya yarı katı ortamlarda uygulanır. Bu ortamlar antijen ve antikor moleküllerinin rahatlıkla hareket edebildiği ve spesifik moleküllerin birbirleri ile reaksiyona girebildiği ortamlardır.
• Aglütinasyon: Aglutinasyon, partiküler yapıdaki antijen ile homolog antiserumun bir araya gelmesi sonucu oluşan reaksiyonlara verilen isimdir. Aglutinasyon reaksiyonunda antijen partikül halindedir ve bivalan yapıdaki spesifik antikorlar ile reaksiyona girdiklerinde kümelenirler. Aglutinasyon reaksiyonlarına katılan antijenlere aglutinojen, antikorlara ise aglutinin adı verilir. Aglutinojenlere örnek olarak bakteriler, kan hücreleri verilebilir. IgG ve IgM’ler güçlü aglutininlerdir. Aglutinasyonun mekanizması diğer sekonder bağlanma testlerinde olduğu gibi iki basamaklıdır. İlk basamakta aglutinojen ve spesifik aglutinin bir araya gelerek spesifik determinantları ile bağlanırlar. Bu dönem reversible’dir ve ısı, pH, elektrolit dengesi gibi çeşitli faktörlerden etkilenir. İkinci basamakta ise antijen - antikor moleküllerinin determinantları arasındaki bağ oluşan köprüler ile güçlenir ve irreversible (geri dönmeyen) immunkompleks oluştururlar. Bir araya gelen antijen-antikor moleküllerinin bu kompleks yapıyı oluşturmalarına lattice (örgü) kuramı adı verilir. Oluşan bu kompleks yapı daha sonra kendi ağırlığı ile dibe doğru çöker ve gözle görülebilir bir çökelti oluşturur, bu çökeltiye “aglutinat” adı verilir. Aglutinasyon testleri başlıca; kan serumunda spesifik antikor saptanması veya vücut sıvılarında antijen saptanması, kan grubu belirlenmesi amaçları ile uygulanan ve kısa sürede sonuç veren testlerdir.
• Komplement fikzasyon : Komplement antijenantikor reaksiyonlarına katılarak hücre lizisine neden olan bir serum proteinidir. Örneğin bir eritrosit hücresi ile spesifik antikor bir araya getirilirse ve ortamda komplement varsa antijen(eritrosit)-antikor kompleksine bağlanan komplement eritrositi lize eder. Komplement fikzasyon (CF) testi komplementin bu özelliğinden yararlanarak serumdaki antikor varlığını ortaya koyan ikincil bağlanma testidir.

Üçüncül bağlanma testleri

Üçüncül bağlanma testleri birincil ve ikincil bağlanma testlerinden farklı olarak test sonuçlarının canlı ortamlarda (deney hayvanı, hücre kültürü, embriyolu yumurta) ölçüldüğü testlerdir. Bazı mikroorganizmalar veya antijenik moleküller çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptirler. Bu biyolojik aktivitelere örnek olarak; hayvanlarda hastalık veya ölüme neden olmak, bazı bakterilerin toksin sentezlemesi, bazı virüslerin çekirdekli hücreleri lize etmesi verilebilir. Mikroorganizmalar veya antijenik moleküller spesifik antikorları ile bir araya getirilirlerse bu biyolojik aktivitelerini kaybederler. Diğer bir ifade ile spesifik antikorlar tarafından bu biyolojik aktiviteler nötralize edilir. Ancak canlı ortamlarda uygulanan bu testlerin değişken faktörleri oldukça fazla olduğundan ve dış koşullardan fazla etkilendiğinden elde edilen sonuçların standardize edilmesi büyük önem taşır. Bu nedenle üçüncül bağlanma testlerinde sonuçlar; test edilen grubun %50’sini infekte eden (ID50) doz veya test edilen grubun %50’sini öldüren (LD50) doz vb. olarak ifade edilir. Üçüncül bağlanma testleri temel olarak iki farklı şekilde uygulanır;

• Nötralizasyon Testleri : Nötralizasyon testlerinin temeli antijenlerin biyolojik aktivitelerinin spesifik antikorlar tarafından nötralize edilmesine dayanır. Test iki aşamada uygulanır. İlk aşamada bilinen antijen ile şüpheli serum in vitro koşullarda bir araya getirilerek inkübe edilir. İkinci aşama in vivo koşullarda gerçekleşir. Bu amaçla ilk aşamada reaksiyona giren karışım deney hayvanı, embriyolu yumurta, hücre kültürü gibi canlı bir ortama verilir ve inkübe edilir. Sonuçta canlı ortamlarda bir değişiklik gözlenmemesi şüpheli serumda antikor bulunduğunu ortaya koyar.
• Koruma (Proteksiyon) Testleri : Koruma testleri nötralizasyon testleri ile aynı temele dayanır ancak tamamen canlı ortamda uygulanması yönü ile farklılık taşır. Koruma testlerinde deney hayvanlarına önce koruma özelliği saptanacak olan spesifik antiserum farklı dilüsyonlarda verilir. Ardından hayvanlar standart dozda bilinen patojenik mikroorganizma veya toksin ile eprüve edilir. Gözlem altında tutulan hayvanlarda ölüm veya hastalık oluşup oluşmadığı incelenir. Şüpheli serumdaki antikor varlığı ve düzeyine bağlı olarak deneme gruplarında yer alan hayvanlarda ölüm/hastalık gibi değişiklikler gözlenir.