Ünite 4: İmmunohistokimyasal ve Moleküler Yöntemler

İmmunohistokimyasal Yöntemler

İmmunohistokimya ; Hücre ve dokularda yer alan endojen ve/veya ekzojen immunojenik yapıdaki maddelerin, özel yöntemlerle hazırlanmış işaretli antikorlar aracılığıyla ışık, floresans ve/veya elektron mikroskopta saptanmasına denilir. immunohistokimyasal yöntemlerde üç önemli temel yapı antijen, antikor ve kromojendir.

Antijen (İmmunojen): Organizmada immun yanıt oluşturabilen ve bunun sonucunda kendilerine karşı özel antikor şekillendirebilen maddelere denir. belli bir antijene karşı elde edilmiş antikorlar başka antijen(ler)le reaksiyona girebilir ve buna çarpraz reaksiyon denir. Antijenler vücutta yapılmalarına ve dışarıdan alınmalarına göre iki grupta incelenirler bunlar; ekzojen antijenler ve endojen antijenlerdir. Endojen antijenler dört grupta toplanırlar. Otoantijenler, alloantijenler, idiotipik antijenler ve heterofil antijenler ’dir.

Antikor: Antijene karşı immun sistem tarafından oluşturulmuş olan Ig yapısındaki tüm bu maddelere antikor denir. Antikorlar A, D, E, G ve M olmak üzere beş tiptir. Antikorlar elde edilme yöntemlerine göre de “monoklonal antikorlar ” ve poliklonal antikorlar olarak iki gruba ayrılırlar.

Antikor Sağlanması, Kullanımı ve Saklanması: Antikorlar toz (liyofilize) halindeyse ve hemen kullanı lmayacaksa +4°C’de saklanır, kullanım sırasında sulandırılır. Sıvı ise küçük miktarlara ayrılarak -20°C’de saklanır. Çözdürme işlemi olabildiğince yavaş yapılmalıdır. Özellikle de floresans verme özelliğine sahip maddelerle bağlanmış antikorlar ışık almayan kaplarda saklanmalıdır.

Hücre ve Doku Örneklerinin Hazırlanması: Hücre örnekleri sıklıkla kan, iğne biyopsisi veya lavajlardan elde edilir. Doku örnekleri ise taze, dondurulmuş veya parafinde bloklanmış doku kesitlerinden hazırlanır.

Nonspesifik Reaksiyonların Engellenmesi: Boyamada kullanılan primer antikor, antijenin dışında hücre duvarı ve pek çok doku proteinleri ile tepkimeye girerek nonspesifik (istenmeyen, özel olmayan) reaksiyonlara sebep olur. Bunu engellemek için ya sığır serum albumini ya da normal keçi serumundan faydalanılır (serum inhibisyonu). Bazı durumlarda, kullanılan antikorların antijenle ya da reseptörlerle daha iyi bağlanabilmesi için “antigen retrieval” adı verilen bir işlem yapılması gerekir.

Boyamada Uyulması Gereken Kurallar:

• Ortamdaki serbest antikorları uzaklaştırmak için kesitler tamponlu solüsyonlarla iyice yıkanmalıdır.
• Kullanılan antikorların sulandırmalarına dikkat edilmelidir.
• Antikor seçiminde özellikle kullanılacak serum ve kimyasalların uyumu sağlanmalıdır
• İstenmeyen reaksiyonlar en aza indirgenmelidir.
• Kullanılan solüsyonların fazlası kurutma kağıdı veya kağıt havlu ile alınmalıdır ya da kesitlerin etrafı özel kalemlerle çizilmelidir
• Boyamada kullanılan solüsyonlarla işlem nem odası içerisinde ve uygun ısıda (+4°C, 37°C) yapılmalıdır.
• Floresans boyamalar karanlık bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

İmmunohistokimyasal Boyama Yöntemleri

İmmunoenzim Boyama Yöntemleri

Boyamanın temeli enzim reaksiyonuna dayandığından immuno-enzim boyama yöntemleri olarak adlandırılmıştır. Çeşitli immunoenzim boyama yöntemi vardır. Bu yöntemler araştırmacıların amaçlarına, istedikleri duyarlılık derecesine, kullanacakları dokuya, maddi olanaklara göre seçilmektedir.

İmmunoperoksidaz Boyama Yöntemleri

Direkt immunoperoksidaz Boyama Yöntemi: Yöntemde doğrudan enzim ile işaretlenmiş primer antikor, dokudaki antijen ile reaksiyona sokulmaktadır.

İndirekt immunoperoksidaz Boyama Yöntemi: Primer antikor önce antijenle bağlanır, sonrasında bağlanan antijen-primer antikor kompleksi enzimle işaretli olan sekonder antikorla bağ- lanır. Bu yöntem direkt yönteme göre daha duyarlı bir yöntemdir.

Enzim Anti-enzim Kompleksi Boyama Yöntemleri: İndirekt yönteme benzemekle birlikte bu yöntemde sekonder antikor işaretlenmemiştir. Ancak enzimle işaretli antikor kompleksi kullanılır. Sekonder antikor hem bu kompleksle hem de antijene bağlı primer antikor ile bağlanır.

Avidin-Biotin Complex Peroxidase (ABC-P) veya Strep Avidin-Biotin Complex Peroxidase (StrepABC-P) Yöntemi ; Bir avidin 4 farklı yerden biyotine bağ- lanma özelliğine sahiptir. Enzim olarak genellikle peroksidaz enziminden faydalanılır.

İmmunofloresans Boyama Yöntemleri :

Floresans görüntülemenin en önemli ve diğer yöntemlere göre ayrıcalıklı yönü antijenle antikorun bağlantı noktasının siyah zemin üzerinde parlak ışımalar halinde görülmesidir.

Direkt immunofloresans Boyama Yöntemi: Direkt immunoperoksidaz boyama yöntemine benzer şekilde dezavantajlara sahiptir ve primer antikorun florokromla bağlanması söz konusudur.

İndirekt immunofloresans Boyama Yöntemi: Direkt yönteme göre daha duyarlıdır, tek bir konjugat halinde çok daha fazla antijenle kullanılabilir, ancak istenmeyen boyanmalara daha sık rastlanır.

Moleküler Yöntemler

Moleküler yöntemlerde önemli olan zamanında uzaklaştırılan dokunun hemen işlenmeye alınması ve bu işlemler sırasında da dokunun moleküler yapısının korunmasıdır. Moleküler patolojide taze veya dondurulmuş doku, FTPB (formalinde tespit edilmiş, parafinde bloklanmış), taze ya da tespit edilmiş iğne biyopsisi örnekleri, kan, kemikiliği ve yanak sıvapları tercih edilmektedir. RNA molekülü DNA molekülünden daha az stabildir. Çoğu moleküler çalışmada taze ya da taze dondurulmuş dokular kullanılmaktadır. Dokudaki makromolekülleri koruyabilen kimyasal solüsyonlar iki genel sınıfa ayrılmaktadır. Bunlar; moleküler koruyucular ve gerçek moleküler koruyucular ’dır.

İdeal moleküler tespit solüsyonların özellikleri sunlardır;

• Zehirli olmamalı
• Değişikliklerden çabuk etkilenmemeli
• Yüksek ısılarda aktif olmalı
• Ekonomik ve etkili olmalı
• Proteolitik özellikleri çok iyi bilinmeli
• DNA, RNA ve proteinlerini korumalı
• Doku oda ısısında uzun süreli (6 aydan fazla) tespitte kalsa bile bu özelliklerin önemli bir şekilde etkilenmemesi gereklidir.

DeoksiriboNükleik Asit (DNA): DNA, linear şekilde dizilmiş iki nükleotid zincirinin oluşturduğu çift sarmallı bir moleküldür ve hücrelerdeki genetik bildi çekirdekte bulunan DNA ile saklanır. DNA’nın yaklaşık %5’i genellikle proteinleri, tRNA, rRNA, mRNA ve diğer küçük nüklear RNA’lar gibi diğer fonksiyonel ürünleri kodlar.

Taşıyıcı RNA (tRNA): Uygun aminoasiti bağlayarak, ribozoma getirir. Taşıdığı üç nükleotidlik gruba antikodon denir.

Ribozomal RNA (rRNA): Yapısal RNA olup ribozomun yapısına katılırlar.

Mesajcı RNA (mRNA): DNA’dan şifreleri alarak protein sentezine kalıplık yapar. mRNA’daki her üç nükleotidlik gruba kodon denir. Her kodon ribozoma aminoasit gelmesini sağlar.

RiboNükleik Asit (RNA): DNA’daki gibi şeker, fosfat ve bazdan ibarettir ancak şeker olarak deoksiriboz yerine riboz, timin yerine de Urasil (U) içerir. En sık rastlananı rRNA ve tRNA’dır ki bunlar toplam hücre RNA’sının %90’ını oluşturur.

Bir populasyonda bireyler arasında DNA sekansında oluşan ve genel populasyonda %1’den fazla sıklıkta bulunan farklılıklara polimorfizm denir. Bir popülasyonun %1’den daha az bulunan ve daha çok bir hastalık nedeni olabilecek şekilde bir genin DNA sekansında oluşan kalıcı değişimlere mutasyon denir.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR): Belirli bir DNA dizisinin in vitro olarak hızlı, peşpeşe ve çift yönlü çoğaltılmasına “polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction-PCR)” denir. PCR reaksiyonu üç aşamadan oluşur:

1. Birinci aşama (denaturasyon)
2. ikinci aşama (annealing)
3. Üçüncü aşama (uzama)

Her PCR yönteminde;

• Primerler
• Deoksinükleosid trifosfat
• Enzimler
• Magnezyum klorür

bulunmak zorundadır.

Thermalcycler Aleti: Kullanılacak thermalcycler aleti ile her bir primer takımı için en iyi denatürasyon, bağlanma ve uzama süresi ile sıcaklıkları ayrı ayrı belirlenebilmelidir. Denatürasyon, bağlanma ve uzama ısılarına ulaşma zamanı olabildiğince kısa olmalıdır.

İşaretlemeler: İşaretlemeler antijenik ve radyoaktif olarak iki farklı şekilde yapılır. işaretlemeler için biotin, digoksigenin ve floresan, 35S ve 33P (radyoaktif yolda tercih edilir) kullanılır.

Kontroller: Pozitif kontrolde amplifikasyon reaksiyonları sonucunda elde edilmesi istenen ürünler oluşmalıdır. Negatif kontrol, amplifikasyon reaksiyonları sonucunda hiç ürün vermemelidir.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu Çeşitleri:

• Reverse Transcription PCR (RT-PCR)
• Real time PCR
• Multiple PCR
• Nested PCR
• In Situ PCR

Birbirini bütünleyen iki DNA zincirinin biraraya gelerek ikili sarmal biçimindeki molekülü (hibrid) oluşturmasına hibridizasyon denir. Floresans in Situ Hibridizasyon (FISH ) da identifiye edilmek istenen genomik sekansı belirlemek amacıyla floresanla işaretli DNA ya da RNA probu kullanılır.

Bir nükleik asit izolasyonu üç aşamada gerçekleşmektedir;

1. Hücre eritilmesi (lizisi)
2. Purifikasyon (saşaştırma) ve izolasyon
3. RNA’ya karşı DNA izolasyonu

Nükleik asit miktarı ölçümü spektrofotometelerde nükleik asit solüsyonunun UV ışığının çeşitli dalga boylarının emilmesinin ölçülmesiyle gerçekleştirilir.

Sıvı ya da kitle ayrımına bakmaksızın matrikste (agaroz, akrilamit) makromolekülleri, elektrik alanı altında hareket hızına göre ayıran yönteme elektroforez denir.

Elektroforez türleri şu şekildedir:

• Kağıt elektroforezi
• Selüloz asetat elektroforezi
• Jel elektroforezi (Poliakrilamid jel elektroforezi [PAGE])
• Agaroz jel elektroforezi
• İmmun elektroforez
• Kapiller elektroforez

Dizisi bilinmeyen bir DNA bölgesindeki nükleotidlerin dizilimin belirlenmesi işlemine DNA sekans analizi denir.

Blotting yöntemleri:

• Southern Blot: Yöntemin temeli DNA izolasyonu, RE parçalanma, jel elektroforez ve nükleik asit hibridizasyonundan oluşur.
• Western Blot (protein immunoblot): doku homojenatı ya da ekstraktındaki spesifik proteinin olup olmadığını ve varsa ne kadar olduğunu saptamak için yaygın olarak kullanılan analitik bir yöntemdir.
• Eastern Blot: proteinlerdeki değişiklikleri, lipid ve glikokonjugatları belirlemek için yarar sağlar.
• Northern Blot: Yöntemde DNA yerine mRNA ve virus RNA’sından yararlanılır.

Hazırlanan bir çözeltiden belirli spektrumlarda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından emildiğinin miktar olarak ölçülmesi yöntemine spektrofotometri denir.