Ünite 3: Boyama ve Mikroskoplar

Boyama Yöntemleri (Histokimya)

Boyama yöntemleri nekropsi ve biyopsi sonucu elde edilen doku örneklerinde gelişen patolojik bulguların mikroskobik olarak belirlenmesi ve görünür hale getirilmesi amacıyla yapılan özel kimyasal uygulama yöntemleridir.

Histokimya laboratuarda çeşitli kimyasal maddeler kullanarak ve dokuda birtakım kimyasal reaksiyonlar oluşturulmasıyla doku ve elemanlarını ayırd etmeye yerleşim ve yayılımları ile miktarlarını tanımaya yarayan kimyasal yöntemlerin adı olarak tanımlanır.

Hematoksilen-Eozin Boyama Yöntemi: Hematoksilen boyası genellikle hücre çekirdeğini koyu mavi-mor renge boyayarak hücre içi ayrıntıyı iyi gösterir. Eozin boyası ise hücre sitoplazmasını pembekırmızı renge boyar. Bazik bir boya olan hematoksilenin oksijenleşmesiyle ortaya çıkan hematein kırmızımtrak-sarı renkte zayıf bir boyadır. Ancak bir mordant ile kullanılırsa koyu ve devamlı bir boya olur.

Mordant: Boya ile iyi bir birleşim oluşturarak boyadoku bağlanmasını kolaylaştıran maddedir.

Aluminyum Alum Hematoksilenler: En sık kullanılan boyama tipidir ve hücre çekirdeğini iyi boyamaktadır. Aluminyumlu hematoksilenlerin tüm formülasyonları progresif ve regresif boyama yapar.

Eozin; Rutin histopatolojik boyamada aluminyum hematoksilene zıt boya olarak ve hücre sitoplazma yanında bağ dokunun da boyamasında kullanılır.

Zıt Boya: Dokuda boyanması gereken kısımların daha iyi görünmesi amacıyla, diğer yapıların farklı bir boya ile boyanmasıdır.

Özel Boyama Yöntemleri

Konnektif ve Kas Dokusu Boyaları

a) Masson’un Trikrom Boyası:

Tespit: % 10’luk tamponlu nötral formalin veya Bouin solüsyonu (Suda doymuş pikrik asit solüsyonundan 75 mL ve %37-40’lık formaldehitten 25 mL karıştırılarak üzerine 5 mL glasial asetik asit ilave edilir)
Bloklama: Parafin (kesitler 5 µm).

b) Van Gieson Boyası:
Tespit: Genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: Parafin (kesitler 5 µm).

Yağ ve karbonhidrat boyaları

a) Oil Red O Boyası:
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin veya sulu genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: Dondurma mikrotomunda (Kriostat) 10- 15 µm

b) Best’in Carmine (Glikojen) Boyası:
Tespit: Alkolik formalin (9 kısım saf alkol - 1 kısım %37-40’lık formaldehit) veya %5’lik asetik aside ilaveten %10’luk formalin alkol. Suda nötral %10’luk formalinle genellikle iyi sonuçlar elde edilebilir. Bloklama: Tercihen parafin kesitler (5 µm).

Pigment ve mineral boyaları

a) Lillie’in Nil Mavisi Boyası:
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin veya genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: 5 µm parafin kesitler.

b) Von Kossa Boyası:
Tespit : %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 5 µm parafin kesitler.

Amiloid boyası:

Kongo Kırmızısı Boyası:
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 5 µm parafin kesitler.

Mikroorganizmaların boyası

a) Gram-Weigert Boyası:
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 5 µm parafin kesitler.

b) Ziehl-Neelsen Boyası:
Tespit: Genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: 5 µm parafin kesitler.

c) Gridley Mantar Boyası:
Tespit: Genel bir tespit solüsyonu.
Bloklama: 5 µm parafin kesitler.

Sinir dokusu elemanları boyaları

a) Holzer Boyası (Glia hücre ve iplikleri için):
Tespit: %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 8-10 µm parafin kesitler.

b) Luxol Fast Blue Boyası (Myelin iplikleri için):
Tespit : %10’luk tamponlu nötral formalin.
Bloklama: 8-10 µm parafin kesitler.

Mikroskoplar

Mikroskop; çıplak gözle görülemeyen yapıların büyütülerek gözlenmesini sağlayan ışık kaynağı ve yerleşik mercek yapıları içeren aletlere verilen addır.

Mikroskop çeşitleri

Işık Mikroskop: Bir ışık mikroskobunda hem mekanik hem de optik kısımlar vardır. Mekanik parçalar; ayarlı tabla, tabladaki tabla konum ayarı ve görüntü netleştirmede rol alan dişli sistemleridir. Optik kısımlar üç mercek sisteminden oluşur. Bunlar kondansatör, objektif ve okülerdir. Kondansatör; incelenen nesneyi aydınlatan bir ışık demeti oluşturacak şekilde ışık kaynağından gelen ışığı toplayarak odaklar, objektif; incelenen nesnenin aydınlatılan görüntüsünü okülere doğru büyüterek yollar, oküler; bu görüntüyü daha da büyüterek gözlemcinin gözüne veya fotograf makinasına ya da morfolojik ölçümler için bilgisayar ekranına iletir. 0.2 µm’den daha küçük nesneler bu aletle seçilemezler.

Faz Kontrast Mikroskop: Bu mikroskop ile boyanmamış canlı hücre ve doku kesitlerinin incelenmesine olanak sağlar. Temel ilkesi ışığın farklı kırılmaya sahip hücre vehücre dışı yapılardan geçerken hız ve yönünü değiştirmesine bağlıdır. Bu değişiklikler yapıların daha açık veya koyu görünmesine neden olur. Özellikle doku kültürü gibi canlı hücresel yapı ların gözlenmesinde kullanılırlar.

Polarizasyon (kutuplaştırma) Mikroskobu: Polarizasyon mikroskobu yüksek düzeyde düzenlenmiş moleküllerden oluşan yapı ların tanınmasını sağlar. Kutuplaştırılmış ışığın titreşim yönünü saptırma yeteneğine çift kırma yani anizotropi adı verilir. Kollagen ve kas lişeri gibi anizotropi gösteren yapıların incelenmesinde kullanılır.

Konfokal Mikroskop: Bir objenin ve görüntüsünün aynı odağa sahip olmasına konfokal denir. Konfokal mikroskop floresansla işaretlenmiş, saptanmış ya da canlı hücrelerde yüksek çözünürlük sağlayarak görüntü elde etme ve elde edilen görüntüleri birleştirerek üç boyutlu yapısı hakkında fikir vermektedir.

Floresans Mikroskop: Floresans; maddeler uygun dalga boyundaki ışık alttan tutulduğunda daha uzun dalga boyunda ışık yayarlarsa meydana gelir. Floresans maddeler karanlık bir zemin üzerinde parlak ışıltılı parçacıklar şeklinde izlenir.

Elektron Mikroskop: Temel olarak elektron mikroskoplarda vakum sistemi, elektromanyetik alan ve kolon olmak üzere üç ana bölüm bulunmaktadır.

Geçirimli elektron mikroskobu (TEM); yüksek çözümleme gücüne sahiptir. Bu çözümleme gücü görüntülenen yapının ayrıntılarını 400.000 kez büyüterek iki boyutlu görülebilmesini sağlar.

Taramalı elektron mikroskobu(SEM); hücrelerin, dokuların ve organların yüzeyine ait üç boyutlu görüntüler oluşturur. TEM’den farklı olarak elektronlar örneğin içinden geçmez.