Ünite 2: Örnek Alma ve Mikroskobik İnceleme Süreci

Giriş

Organizmadan alınan organ ve doku örneklerinin mikroskopta incelenecek hale gelinceye kadar geçen işlemlerin tümü “histolojik teknikler” olarak tanımlanmaktadır.

1.Canlı Örnek İncelemeleri

Canlı inceleme ya doğrudan faz kontrast mikroskop ya da vital veya supravital boyalar kullanarak ışık mikroskop ile yapılır.

2.Cansız Örnek İncelemeleri:

Cansız doku, sıvı ve içeriklerin incelenmesi fiziksel (kaynatma, kurutma, dondurma) ve kimyasal (alkol, civa, formalin) olarak tespit edilmiş ve boyanmış doku kesitleri üzerinde ya da dışkı gibi boyanmamış preparatlarda direkt olarak ışık mikroskopla yapılmaktadır.

Örnek Alma ve Makroskobik Değerlendirme

Nekropsi: Hayvanların neden öldüğünü ortaya koymak ya da deneysel amaçla öldürülen hayvanlardaki bulguları saptamak amacıyla ölüm sonrası yapılan incelemeye denir.

Otoliz: Ölümden sonra doku ve hücrelerin enzimatik olarak yıkıma uğrayıp kendi kendini eritip sindirmesine otoliz denir. Otoliz ilerledikçe bağırsaklar kolayca yırtılır içerik bulamaç kıvamını alır. Karaciğer ve böbrek gibi organlar parmakla basıldığında parçalanır.

İskemi: Kan dolaşımının durması sonu kan akımının olmaması durumuna denir.

Örnek Alma: Salgın bir hastalık söz konusu ise uzman, sistematik olarak tüm organ ve dokulardan laboratuvar incelemeleri için örnek toplamalıdır. Farklı laboratuvar incelemeleri için alınacak örnekler de farklı saklama yöntemlerine göre alınarak ilgili laboratuvara gönderilmelidir.

• Mikrobiyolojik İncelemeler
• Parazitolojik İncelemeler
• Kimyasal ve Toksikolojik İncelemeler
• Histopatolojik İncelemeler
• Sitopatolojik İncelemeler
• Elektron Mikroskobik İncelemeler

Lezyon: Dokunun sınırlı patolojik ve/veya travmatik olarak bütünlüğünün ve fonksiyonunun bozulmasına denir.

Palpasyon: Dokunma duyusundan yararlanılarak elle yapılan muayeneye denir.

Süspansiyon: İçerisinde dokuya ait parçacıkların bulunduğu sıvıya denir.

Grid: Elektron mikroskobik incelemelerde histolojik incelemelerdeki lamın karşılığıdır.

Makroskobik Değerlendirme:

Nekropsi sonrası veya farklı kliniklerden biyopsi materyali olarak gönderilen organ ve doku örneklerinin makroskobik olarak çıplak gözle değerlendirilmesi ve mikroskobik inceleme için alanlar belirlenmesi makroskobi odası olarak tanımlanan aydınlık ve iyi havalandırılmış bir odada yapılır

Trimleme: Mikroskobik kesitler için organ ve dokular› keserek küçültme işlemine denir.

Tespit (Fikzasyon)

Fikzasyon işlemi fiziksel ve kimyasal yollarla yapılabilir. Dondurma ile tespit, hücresel yapıların histolojik değerlendirmesi çok düzgün olmamakla birlikte hızlı tanıda kullanılır. Kimyasal tespit ise en çok kullanılan yöntemdir.

Kimyasal tespit solüsyonları;

1. Aldehitler (formaldehit, glutaraldehit, glioksal)
2. Okside Ediciler (osmium tetroksit, potasyum permanganat, potasyum dikro.
3. Protein Yıkımlayanlar ve Pıhtılaştıranlar (asetik asit, metil alkol, etil alkol)
4. Diğer Çapraz Bağ Oluşturanlar (karbodiimidler)
5. Di¤er (civa klorid, pikrik asit, aldehit içermeyenler) olmak üzere sınflandırılırlar.

Zoonoz hastalıklar: Hayvanlardan insanlara geçen hastalıkların tümüne verilen genel addır.

Tespit Solüsyonunun Amaca Göre Seçilmeli, Tespit Solüsyonunun Miktar›;1:50 -1:100 oran› bildirilmektedir, ancak 1:15-1:25 oran› ile de uygun sonuç alınabileceğini belirtmek gerekir. Buna uymayan osmium tetroksitin %1- 2’lik solüsyonu için oran 1:5’dir.

Doku örneklerinin tespit solüsyonu içerisinde bulundurulma süresini etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunlar :

1. Örneğin Büyüklüğü.
2. Tespit Solüsyonunun Derine İnme (difüzyon) Gücü.
3. Ortamın Isısı.
4. Amaç.
5. Doku Örneğinin Yapısı.

Tespit Uygulama Teknikleri

Tespit işleminde immersiyon (daldırma) ve perfüzyon (basınçla uygulama) olmak üzere iki yol kullanılır.

En Çok Kullanılan Tespit Solüsyonları:

• Aseton
• Etil Alkol
• Asetik Asit
• Formalin

Birkaç Kimyasal İçeren ve Çok Kullanılan Tespit Solüsyonları:

- Nötral Buffer Formalin: (% 37-40 formaldehit 100 ml + distile su 900 ml +sodyum dihidrojen fosfat monohidrat 4 gr + disodyum hidrojen fosfat anhidroz 6.5 gr)

- Carnoy’un Tespit Solüsyonu: ( Saf etil alkol 60 ml + kloroform 30 ml + glasial asetik asit 10 ml);. - Bouin’in Tespit Solüsyonu: (pikrik asitin suda doymuş solüsyonu 75 ml + % 40 formaldehit 25 ml + glasial asetik asit 5ml)

- Zenker’in Tespit Solüsyonu: (distile su 100 ml + potasyum dikromat 2.5 gr + civa klorür 4-5 gr +glasial asetik asit 5 ml sodyum sülfat 1 gr)

Sitopatolojide Tespit:

Hazırlanan yayma ve tuşe preparatlarda tespit ıslak ya da kuru olabilir. Islak tespit için hazırlanan preparat, çoğunlukla % 96’lık etil alkolde 10 dakika bırakılarak yapılır.

Elektron Mikroskopide Tespit

Tespit sıvısı olarak birinci tespitte en çok stok solüsyonundan hazırlanmış % 2.5’luk buffer glutaraldehit (% 25 glutaraldehit stok solüsyon 10 ml + 0.1 mol/L kakodilat buffer pH: 7.4) ikinci tespitte ise sulu % 2’lik osmium tetroksit (osmium tetroksit 1.0 gr + distile/deiyonize su 50 ml) kullanılır.

Dekalsifikasyon (kalsiyumsuzlaştırma)

ilk olarak bu sert dokular içerisinde bulunan kalsiyumun uzaklaştırılarak dokunun yumuşatılması gerekir. Bu işleme ise dekalsifikasyon (kalsiyum uzaklaştırma, kalsiyumsuzlaştırma) denir.

Doku İşlenmesi Süreci

Doku işlenmesi; makroskobik olarak saptanan lezyonlu ya da normal organ ve doku örneklerinin mikrotomla kesilebilmesi için yapılır.

• Yıkama
• Dehidrasyon (Suyu Giderme)
• Düşük Saydamlaştırma (Alkolü Giderme)
• Emdirme

Otomatik Doku İşlenmesi;

Günümüzde yarı kapalı vakumlu/vakumsuz dönerli (karosel) veya kapalı pompalı dolap tipi olmak üzere iki tip doku işleme aleti bulunmaktadır.

Elektron Mikroskopide Doku İşlenmesi;

Tespit edilen doku örnekleri tamponla yıkanır dereceli alkollerden (% 70, 90, 95, 100 saf alkol) geçirilerek tamamen dehidrasyonu yapılır, propilen oksitte saydamlaştırılır ve epon veya araldite emdirilerek kapsül şeklinde veya lastik/plastik kalıplarda bloklanır. Daha sonra etüvde blok materyaline göre değişen derecedeki ısılarda sertleştirilir.

Parafine Gömme (Bloklama)

Emdirme materyalini iyice emmiş olan doku örnekleri yine aynı materyal içerisine gömülür. Bu amaçla özel kalıplar içerisine emdirme materyali doldurulur.

Desikatör: Nemsiz ortam sağlayan cam kaplara denir.

Kesit Alma

Parafine gömülerek homojen bir biçimde sertleşmiş olan blok, mikrotom adı verilen aletle kesilir.

Dondurma Kesiti Alma

Cerrahi uygulamalar sırasında, deneysel çalışmalarda ötanazi uygulanmadan hemen önce veya agoni durumundaki hayvanlardan alınan doku örneklerinden kriostat adı verilen aletle dondurma kesiti alınır. Bu tip kesit alma; hızlı sonuç istenen olgularda, immunohistokimyasal (immunofloresan ve bazı immunohistokimyasal) çalışmalarda, enzim çalışmalarında ve özellikle rutin doku işlenmesi esnasında kaybolan lipid ile bazı karbonhidratların saptanmasında kullanılır.

Ötanazi: Canlıyı acı vermeden öldürmeye ötanazi (euthanasie) denir.

Eu= iyi;

thanaise= ölüm demektir.

Bu durumda ötanazi, kolay ve rahat ölüm anlamına gelmektedir.

Agoni: Ölüm öncesi dolaşımın zayıflaması sonu beynin kansız kalmasıyla şekillenen can çekişme haline denir.