Ünite 2: Mikroskop ve Mikroskop Türleri

Giriş

İnsan gözü 200–250 µm’den daha büyük olan nesneleri görebilir. Ayırt etme gücü ise 100 mikrona (µm) kadardır yani 100 µm’den ince ise iki çizgi tek çizgi olarak görülür. Bu limitlerin altındaki mikroskobik dünya ancak görme ve ayırt etme gücümüzü artıran aletlerin keşfi ile olmuştur. Mikroskop, Yunanca “mikro” ve “skop” kelimelerinden meydana gelmiş bileşik bir kelimedir. Mikro, küçük; skop, bakıcı, gözleyici anlamına gelir. Mikroskop gözle göremediğimiz varlıkları görünür hale getirir.

Mikroskopların temelini oluşturan ilk basit büyütecin Roger Bacon tarafından yapıldığı ve bazı objelerin incelendiği bilinmektedir. Hollandalı bir tüccar ve amatör bir mercek yapımcısı olan Antony van Leeuwenhoek 200 defadan fazla büyütebilen ve iki metal arasına yerleştirilmiş bikonveks mercekten oluşan büyütme aleti ile yaptığı çeşitli incelemelerde mikroskobik canlılar dünyasını bulmayı başarmıştır. Bu nedenle kendisine mikrobiyolojinin kurucusu gözü ile bakılmıştır. İlk bakterileri 1676 yılında görerek, şekil ve hareketlerini izlemiştir.

Mikroorganizmaların ve ökaryotik organizmalara ait hücrelerin büyüklüklerini belirlemede uluslararası metrik sisteme ait ölçü birimlerinden yararlanılır. Ökaryot hücreler ve bakteriler mikrometre, virüsler nanometre, atom ve moleküller de angstrom olarak ölçülmektedir.

Farklı amaçlar için geliştirilmiş farklı donanımlara sahip mikroskoplar; sağlık alanında da tanı ya da tedavi takibinde vazgeçilmez unsur haline gelmiştir. Sıklıkla kullanılan mikroskop çeşitleri arasında ışık, stereomikroskop, faz-kontrast, interferens, karanlıkalan, polarizasyon, ultraviyole ve elektron mikroskopları sayılabilir.

Işık Mikroskobunun Bölümleri, Kullanımı ve Bakımı

Işık mikroskopları mekanik, optik ve aydınlatma bölümlerinden oluşur.

Mekanik bölüm, mikroskop tüpüne desteklik eden ve mikroskobun taban kısmı ile bağlantı sağlayan kısmı olan mikroskop kolu, yuvarlak veya dört köşe olup preparatın yerleştirildiği ve preparat tablası incelenecek olan nesnenin sabitlenmesi veya konumunun bozulmadan yer değiştirilmesi gibi işlevleri yerine getiren parça olan mikroskop tablası, en küçük objektifte görüntüyü bulmak için kullanılan kaba ayar vidası olan makrovida, Kaba ayar yapıldıktan sonra objenin istenen kısmını daha ayrıntılı görebilmek için objektif büyütmesi arttırmaya yarayan mikrovida, Mikroskop at nalı, oval veya düz ağır bir ayakla (taban) sağlam olarak düz bir zemin üzerine konulmasını sağlayan ayak ve oküler ve objektif merceklerinin bulunduğu kısım olan mikroskop tüpünden oluşur.

Optik Bölüm, mikroskopta incelenen objeleri büyüterek görüntü elde edilmesini sağlayan kısımdır. Optik kısım objektif ve okülerden meydana gelir. Objektif, Farklı büyütme kapasitelerine sahip olan objektifler birçok mercekten meydana gelmiştir. Mikroskoplarda objektifler 4 veya 5 adet olabilir. Optik kısmın objeye en yakın bölümünü oluşturan objektifler, mikroskop tüpünün altına yerleştirilmiş ve orta eksen etrafında dönebilen bir tablaya (rovelver) bağlanmışlardır. Oküler: Optik kısmın gözle bakılan ve tüpün üst kısmına konulan parçasını oluşturur. Alt ve üst olmak üzere çift merceklidir, üzerlerinde 5x, 10x, 15x, 20x gibi kaç kez büyütme yaptıkları yazılıdır. Okülerlerin görevi objektif tarafından oluşturulan obje görüntüsünü büyütmek ve objektifin bazı hatalarını düzeltmektir.

Aydınlatma Kısmı ise ışık kaynağı, kondensatör ve diyaframdan oluşmaktadır.

Işık mikroskobunu kullanırken izlenmesi gereken işlem basamakları şu şekildedir:

Kuru objektif ile inceleme yaparken;

• Oküler ve objektifler temizlenir.
• Mikroskobun ışığı açılıp diyaframı kısılır.
• En küçük büyüten objektif ışık yoluna getirilir.
• Preparat üst yüzü objektife bakacak şekilde tablaya yerleştirilir ve incelenecek bölüm ışık yolu üzerine getirilir.
• Okülerin aralığı incelemeyi yapan kişinin göz aralığına göre ayarlanır.
• Işık ve diyafram ayarları yapılır.
• Okülerden bakarak görüntü görülünceye kadar makro ayar vidası çevrilir.
• Tekrar ışık ve diyafram ayarları yapılır.
• Mikro ayar vidası ile görüntü netleştirilir.
• Şaryo ayar vidaları ile farklı görüntü alanları incelenir.
• Daha fazla büyüten bir objektifle inceleme yapılacaksa revolver yardımı ile istenilen objektif ışık yolu üzerine getirilir.
• Mikro ayar vidası ile görüntü netleştirilir.
• Her büyütmede ışık ve diyafram ayarı tekrar yapılır.
• Preparat değiştirileceğinde veya inceleme sonlandırılacağında revolver yardımı ile en küçük büyüten objektif ışık yolu üzerine getirilir.
• Mikroskop usulüne uygun olarak temizlendikten sonra plastik veya kumaş bir örtü ile örtülür.

İmmersiyon objektifi ile inceleme yaparken ise;

• Kuru objektifte inceleme yapılırken immersiyon objektifi ile incelenmek istenen yer görüntü alanının ortasına getirilir.
• 40x büyütmeli objektif ile bakılarak görüntü alanı belirlenir.
• Preparat üzerinde belirlenen, incelenecek bölgeye bir damla immersiyon yağı damlatılır.
• İmmersiyon objektifi ışık yolu üzerine getirilir.
• Mikro ayar vidası yardımıyla görüntü netleştirilir.
• İnceleme bittiğinde makro ayar vidası ile tabla en alt seviyeye indirilir.
• İmmersiyon objektifi ışık yolundan uzaklaştırılır.
• Preparat çıkartılır.
• Mikroskop usulüne uygun olarak temizlendikten sonra örtülür.

Işık mikroskobunda incelenecek materyal taze veya kuru olabilir. İncelenecek organ ya da dokuda görülmek istenen kısıma göre kesit alınır. Mikroskopta oluşacak görüntünün net olabilmesi için kesitler olabildiğince ince alınmalıdır.

Mikroskop Bakımı; mikroskopta incelenen objenin görüntüsündeki netlik; toz parçacıkları, oküler ya da objektifin elle veya göz ile teması sonucu bozulabilir. Bir mikroskoptan iyi bir görüntü elde edilmesi büyük oranda mikroskobun bakımı, temizliği ve ayarlanması ile ilgilidir. Bu nedenle mikroskobun temizlik ve bakımına önem göstermek gerekir.

Mikroskop Türleri

Farklı amaçlara uygun olarak laboratuvarlarda çok çeşitli mikroskoplar kullanılmaktadır.

Stereomikroskop (Binoküler): Stereo mikroskoplar ışık mikroskobundan farklı olarak sabit dürbün mantığı ile çalışır ve üç boyutlu görüntü elde etmeyi sağlar. Belirli noktalara kadar görüntüyü yakınlaştırabilen tek objektifin kullanıldığı binoküler mikroskoplar düşük büyütme ile derinlikli görüntü elde etmek için ve gözle görülen cisimlerin yüzeyini incelemek amacıyla kullanılırlar. Lam ve lamel kullanılmadan yani herhangi bir preparasyon yapılmadan incelenecek obje tabla üzerine yerleştirilir. Stereomikroskoplar beyin ve gözleri birlikte çalışarak, farklı açıdan alınan iki görüntüyü üst üste çakıştırır ve üç boyutlu, uzaysal bir görüntü oluşturur. Buna stereoskopik görüntü adı verilir.

Faz Kontrast Mikroskobu: Sıvı ortamda boyasız olarak incelenen obje veya özellikle hücreler ya da iç yapılarının görülmesi zordur. Çünkü, protoplazma ile diğer hücre içi yapıların ve preparattaki oluşumların, içinde bulundukları sıvı ortamın ışığı kırma indisleri arasında büyük bir fark yoktur. Çünkü hücre fazla miktarda su içermektedir. Bu niteliği geliştirmek amacı ile faz kontrast mikroskobu geliştirilmiştir. Bu amaçla kullanılan mikroskopların ışık mikroskobundan iki önemli farkı vardır: Bunlardan birisi, ışık kaynağından gelen ışığın, kondansatörden önce yerleştirilmiş ve yalnızca bir halka yarığı aracılığı ile ışık geçiren bir diyaframdan geçerek kondansatöre gelmesidir. Bu diyaframlar yalnız halka kısmı saydam, diğer kısımları ise opak camdan yapılmıştır. İncelemede kullanılan her objektif için amaca uygun olacak biçimde değişik ve ayrı diyaframlar kullanılır. İkinci fark ise faz kontrast mikroskoplarında özel faz objektiflerinin kullanılmasıdır. Bu objektiflerin arka odak bölgelerinde özel yapıda bir camı bulunur ve görevi üzerindeki belirli halka bölgesinden geçen ışınları, diğer yerlerinden geçen ışınlara göre 1/4 dalga boyu kadar yansıtarak geçirmesidir.

İnterferens Mikroskobu; Faz kontrast mikroskobunda olduğu gibi bu mikroskopta da materyali oluşturan çeşitli yapıtaşları ve hücre kısımlarının kırılma indisleri farklarından kaynaklanan kontrast farklarından yararlanılır. Faz farkları çok canlı renklere dönüştürülebilmekte ve canlı bir hücre sanki boyanmış bir preparat gibi görülebilmektedir.

Karanlık Alan Mikroskobu (Ultramikroskop)

Bazı objeleri normal ışık mikroskobu ile görmek imkansızdır. Karanlık alan mikroskopisi için kullanılan mikroskoplar normal ışık mikroskoplarıdır. Karanlık alan mikroskopisi için ışık mikroskobunda üç değişikliğe ihtiyaç vardır. Işık kaynağı olarak ışığı yoğunlaştırarak yönelten ve daha iyisi üzerinde bir toplayıcı mercek ve bir diyafram bulunan güçlü (250 W) bir lamba kullanılır. Işınları eğik yansıtarak preparatın üzerinde tepesi aşağıda bir koni oluşturacak şekilde yönelten bir toplayıcı mercek (kondansatör) mikroskobun kondansatörünün yerine bağlanır. Bu amaç için en çok paraboloid kondansatörler kullanılır. Bu kondansatörün özelliği, dış kaynaklı hiçbir direkt ışığı objektife iletmeyişidir. Üçüncü olarak yapılması gereken değişiklik, içerisinde bu amaç için konulmuş bir diyafram bulunan ve bunun aracılığı ile sayısal açıklığı azaltabilen bir objektifin kullanılmasıdır.

Polarizasyon Mikroskobu: Kondansatörün (aydınlatma sistemi) altına konan bir polarizatör (polarlayıcı bir levha ya da prizma) yardımı ile tek düzlemde polarlanmış bir ışık, obje üzerine düşürülürse bu ışık iki yola ayrılır. Bunlardan biri kırılır, diğeri ise objeden farklı bir hızla geçer. Objeden çıkan bu iki ışık demeti yeniden birleşir, fakat hızları farklıdır. Bu faz farkı, polarize mikroskopta nicel olarak ölçülür. Polarizasyon mikroskobu, taze ve tespit edilmemiş materyalin araştırılmasında, molekül yönlenmelerinin belirlenmesinde, hücresel yapıların kimyasal bileşimleri, sitoplazma, kromozomlar, iğ iplikleri, asterler, kas telleri, sinir lifleri gibi hücresel yapıları, tırnak, boynuz ve kemik kesitlerini, kristalize hormonları ve vitaminleri incelemede ve özellikle mineralojide mineral yapıların araştırılmasında kullanılmaktadır. Ayrıca polarizasyon mikroskobundan bir objenin izotropik mi yoksa anizotropik mi olduğunun belirlenmesinde de yararlanılmaktadır.

Ultraviyole Mikroskobu; Bir obje üzerine mor ötesi ışık (UV) düşürülür ya da objenin içinden geçirilirse obje onu absorblar ve görünür bir ışık enerjisi (mavi, mor, yeşil, sarı, turuncu, kırmızı) saçarsa o madde fluoresanstır. UV ışınları kaynağı olarak hidrojen kuvarz lambaları, yüksek basınçlı civa arkları ve ksenon arkları kullanılır. Bazı biyolojik maddelere fluoresans veren boya ya da kimyasallar uygulanması ile yapay fluoresans oluşturulabilir. Mor ötesi ışık camdan geçmediği için bu yöntemde, mikroskobun aydınlatma sisteminde kuvars mercekler ve alüminyum aynalar kullanılması gereklidir.

Genellikle ultraviyole (360 nm) ya da mavi ışık (400nm) kullanılır.

Cerrahi Mikroskop; Cerrahide büyütücü mercekler ilk kez 1886 yılında bir göz hekimi olan Zehender tarafından kullanılmıştır. İlk ameliyat mikroskobu ise 1921 yılında Nylen tarafından tasarlanmış ve kulak burun boğaz ameliyatlarında kullanmlıştır. Nylen’in kullandığı cerrahi mikroskop monoküler bir mikroskopken, aynı klinikten Holmgren, Zeiss firmasıyla birlikte 1923 yılında ilk binoküler cerrahi mikroskobu geliştirmiştir. Cerrahi mikroskoplar kulak burun boğaz, kalp damar cerrahisi, göz ameliyatlarında, beyin cerrahisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Elektron Mikroskopları

Elektron mikroskobunda (EM) ışık yerine elektron akımı, cam mercekler yerine ise elektromanyetler kullanılır. EM’de ışık kaynağı, elektron aygıtında ısıtılan tungsten tellerinden çıkan elektron akımı, elektronun geçtiği ortam havasız ve mercekler elektromanyetiktir. Odak ayarlama ve büyütmeyi değiştirme ise manyetik merceklere akım ayarlanması ile yapılır. Başlıca iki çeşit elektron mikroskobu kullanılmaktadır: 1. Geçirme (transmisyon) elektron mikroskobu (TEM) 2. Tarama (scanning) elektron mikroskobu (SEM).