Ünite 3: İleri Moleküler Tanı, Tektik Cihaz ve Malzemeleri

Giriş

DNA teknolojisinin hızlı gelişimi; DNA örneğinin her geçen gün daha hızlı ve kolay elde edilmesi, gittikçe daha doğru ve güvenilir sonuçlar elde edilebilir hale gelmesi ve otomatik işleme olanaklarının gelişmesi ile birlikte teknolojinin ucuzlaması tanı ve tedaviye yönelik pek çok yeni bilgi ve yaklaşımın kullanılmasına olanak sağlamıştır.

Tıpta moleküler tanı kavramı; moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak genomun (genomik/transkriptomik), proteinlerin (proteomik) veya metabolitlerin (metabolomik) tıbbi amaçlı analiz edilmesi işlemlerini kapsar.

Tıpta moleküler tanı için kullanılan cihazlar ve teknoljiler içinde bulunduğumuz yüzyılda baş döndürücü bir hızla gelişmiştir. Genetik başta olmak üzere sağlık ile ilgili pek çok bilim disiplininde ileri teknoloji ürünü cihazlar moleküler tanı için kullanılmaktadır.

Nükleik Asit İzolasyonunda Kullanılan Cihazlar

Moleküler tanı yöntemlerinin uygulanması yüksek kalitede ve yeterli miktarda nükleik asitin (DNA veya RNA örneği) varlığını gerektirir. Bu amaçla kullanılan pek çok farklı yöntem ve cihaz mevcuttur. DNA örneği kan, tükürük, saç kökü ve amniyon sıvısı gibi içinde çekirdekli hücre bulunduran her türlü materyalden elde edilebilir. Kullanılacak yöntem ya da sistem amaca ve işlemin yapıldığı laboratuvarın şartlarına bağlı olarak değişir. DNA ve RNA izolasyonu manuel yöntemlerle yapılabildiği gibi otomatize sistemler de kullanılmaktadır. İzolasyon üç temel basamak içerir:

1. Hücrenin paralanması ve DNA ya da RNA molekülünün açığa çıkartılması,
2. DNA’nın protein kompleksinden ayrılması ve çözünür hale getrilmesi,
3. Çeşitli fiziksel ya da kimyasal yöntemler ile DNA ya da RNA’nın proteinler ve diğer makro moleküllerden ayrılması.

Bu basamaklar manuel olarak uygun kimyasallar ve kitlerle yapılabileceği gibi otomatize kapalı sistemler ile de gerçekleştirilebilir. İzolasyonun otomatize olması hem daha kısa sürede daha çok örneğin izolasyonuna imkan verir hem de kontaminasyon (bulaşma) riskini en aza indirir. Kontaminasyon hem elde edilmek istenen örneğe bir başka materyalin bulaşmaması hem de izolasyonu yapan laboratuvar çalışanına örnekten herhangi bir patojen bulaşmamasını ifade eder. Ayrıca kapalı otomatize sistemler insan müdahalesini en aza indirerek standardizasyonu yükseltir.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Özgün bir DNA örneği üzerinde moleküler analizlerin yapılabilmesi için DNA moleklünün istenen kısmının çoğaltılması gerekir. İn vivo koşullarda DNA molekülü replikasyon ile çoğalır. DNA sarmalının açılarak iki atasal zincirin karşısına yeni zincirlerin sentezlenmesi replikasyon olarak adlandırılır. Replikasyon hücrede bölünmeyi takiben her yavru hücreye özdeş genetik materyal dağılmasını sağlar. DNA molekülü in vitro koşullarda polimeraz zincir reaksiyonu adı verilen bir dizi işlem ile çoğaltılır.

Polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) yöntemi, bir organizma veya mutant gene ilişkin normal ya da parçalanmış DNA veya RNA’nın in vitro çoğaltılmasına imkan veren bir yöntem olup, 1985’te K. Mullis ve arkadaşlarınca ilk olarak keşfedilmiş, daha sonra Saiki ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir.

PCR yöntemi kısaca bir gen ya da DNA bölgesinin, bu hedef bölgenin uç bölgelerine bağlanan oligonükleotit primerler aracılığıyla bir dizi replikasyon geçirerek kendisini çoğaltması işlemidir.

Reaksiyondaki her döngü üç evreden oluşmaktadır. Bu evreler; denatürasyon, primer bağlanması (annealing) ve primerlerin uzaması (extension) evreleridir. Bir döngü 3-5 dakika sürer ve 20-30 kez tekrarlanır. Bir döngü sonunda sentezlenen ürün öncekinin iki katı kadardır. Denatürasyon Evresi: Çoğaltılması istenen DNA molekülü, 95o C’de 30 sn. ya da 97o C’de 15 sn. tutularak denatüre edilip tek dal haline getirilir. Primer Bağlanması (Annealing) Evresi: Primer adı verilen ve hedef DNA bölgesi için spesifik olan 18-24 baz uzunluğundaki oligonükleotid, denatürasyon sonucu oluşan DNA tek dalındaki kendine komplementer olan nükleotid dizisine bağlanır. Primerlerin bağlanması için ortam ısısı 40- 60o C’ye düşürülür. Primerlerin Uzatılması (Extension) Evresi: Bağlanma tamamlandıktan sonra primer hibritleştiği tek dalın karşılığını sentezler. Bu sentez için termostabil özelliği olan ve Thermus aquaticus adlı bakteriden elde edilen Taq polimeraz enzimi kullanılır. Bu enzim PCR’la DNA sentezi için gerekli olan yüksek optimum ısıya (Topt) sahiptir. Taq polimeraz 72o C sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılmaktadır.

PCR ile elde edilen amplifikasyon ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit bilgi elde edilebilir:

1. Hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi
2. Hedef DNA ya da RNA’nın miktarının belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün miktarının ölçülmesi
3. Dizi analizi

Günümüzde PCR yöntemi mutasyonların tanımlanması, prenatal tanı, adli tıpa ilişkin DNA dizi analizleri, bakteriyel ve viral infeksiyonların taranması ile genomik DNA dizi analizi çalışmaları gibi işlemlerde rutin olarak kullanılmaktadır.

PCR Çeşitleri

İç içe (Nested), PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumunu engellemek ve PCR tekniğinin spesifikliğini arttırmak için kullanılan bir PCR yöntemidir.

Ters (Reverse) Transkripsiyon PCR (RT-PCR), Rekombinant DNA teknolojisinde bazı mutasyonların analizi DNA üzerinden değil RNA üzerinden yapılmaktadır. RNA analizlerinin DNA’dan farkı yalnızca ekzon baz dizilerine sahip olmaları ve protein ekspresyonu çalışmalarında kullanılabilmeleridir. Bu yöntemde önce mRNA’dan reverse transkriptaz enzimi yardımıyla cDNA sentezlenir. Sonra cDNA’nın PCR ile çoğaltılması gerçekleşir. Bu aşamadan sonra pek çok farklı analiz yöntemiyle aranan marker saptanabilir.

Kademeli Sıcaklık Düşürme (Touchdown) PCR yönteminde optimal primer bağlanma derecesini belirlemek amacıyla başlangıçta primer bağlanma sıcaklıkları yüksek tutulup sikluslar arasında 1-2°C düşürülerek uygun sıcaklık derecesi belirlenir. Daha sonraki amplifikasyon siklusları bu sıcaklıkta tamamlanarak hedef bölge çoğaltılmaktadır.

Çoklu (multipleks) PCR , aynı DNA kalıbı kullanılarak çok sayıda gen veya ürününün birden fazla primer seti kullanılarak çoğaltılması işlemidir.

Eş Zamanlı (Real-Time) PCR ; Moleküler genetikte yaygın olarak kullanılan yöntemlerin çoğu, hedef molekülün PCR yöntemi ile çoğaltılması esasına dayanır. PCR yöntemi ile çoğalma süresince floresan ölçümler yapabilen eş zamanlı PCR cihazlarının gelişmesi ile kantitatif sonuçlar elde etmek ve tek tüpte farklı mutasyonları eş zamanlı olarak belirlemek mümkün hale gelmiştir.

Eş zamanlı PCR sistemi klasik PCR kullanımına göre pek çok avantaj ve dezavantaja sahiptir. Bunlar:

Avantajları

• Yöntemin en önemli avantajları arasında hassas, verimli, hızlı ve kontaminasyon riskinin düşük olması sayılabilir.
• Klasik PCR belirli sayıda çevrimden sonra ölçüme izin verirken eş zamanlı PCR veriyi eksponansiyel büyüme fazında elde eder.
• Raportör floresan sinyalindeki artış doğrudan üretilen PCR ürün miktarıyla orantılıdır.
• Hedef sekansı tespit eden dinamik aralık oldukça geniştir.
• PCR sonrası ek işlemlere ihtiyaç duymaz.
• Duyarlılık başlangıç materyalindeki sadece 2 katlık bir değişime kadar düşürülebilmektedir.

Dezavantajları:

• Amplikon boyutu sistem açılmaksızın takip edilememektedir.
• Mevcut sistemler multipleks yetkinliğini sınırlandırmaktadır.
• Bazı sistemler florejenik kimyasallarla uyumsuzluk göstermektedir.
• Kullanılan teknoloji, kalite yetkinlik ve kontrol düzenlemeleriyle denetlenirse güvenli sonuçlar vermektedir.
• Standardize edilmiş analiz sistemleri ise her yeni uygulamada optimizasyona ve validasyona ihtiyaç duyar. Aksi halde eş zamanlı PCR sistemi oldukça fazla miktarda ancak doğru olmayan veri sunacaktır.

Bu yöntemin geliştirilmesinden sonra birçok farklı yöntem daha ortaya konmuş ve birçok eş zamanlı PCR cihazı giderek artan sayıda üretilmiştir. Amplifikasyon sürecini göstermek için farklı boya ve problar kullanılmaktadır. Bunlar:

Dizi spesifik olmayan floresan boyalar: Bu tür boyalar DNA molekülünün tamamına bağlanabilen boyalardır. Sıklıkla kullanılan SYBR Green I boyası, çift sarmallı DNA’ya bağlanarak floresan sinyallerin artmasını sağlar ve genellikle gen dozajını belirlemek için kullanılır.

Dizi spesifik floresan problar: Hedef diziye özgül ve floroforlarla işaretli problardır. Spesifik DNA dizisi mevcut ise reaksiyona katılırlar. Dizi spesifik problar hibridizasyon ve hidroliz problarını içerir.

Hibridizasyon probları: Fluorescence Resonance Energy Transfer “FRET” prensibi ile çalışırlar. FRET, 3’ ucu floresan işaretli bir verici probdan yakındaki 5’ ucu floresan işaretli alıcı proba enerji transfer etme işlemidir. Hibridizasyon probları genellikle erime eğrisi analizi ile tek nükleotid değişimlerinin saptanması için kullanılır.

Hidroliz probları (TaqMan): Taq polimerazın 5’ – 3’ nükleaz aktivitesinden yararlanan prob sistemidir. Mutasyon tayini, PCR amplifikasyonu sonrası iki alele özgül raportör boyanın sinyal yoğunluğunun ölçülmesiyle yapılır.

Moleküler İşaret Fenerleri (Molecular Beacons): TaqMan probunun geliştirilmiş şekline moleküler işaret feneri (molecular beacons) adı verilmiştir. TaqMan probundaki oligonükleotidlerin orta kısmındaki spesifik bölgelere ek olarak, probun 5’ ve 3’ uçlarında komplementer sekanslar bulunur. Bu sekansların görevi probun uçlarının kıvrılarak saç tokası şeklini almasını sağlamaktır. Böylece quencer ve raportörün birbirine ışığın emisyonunu önleyecek kadar yakınlaşması garantilenir.

Görüntü Analiz Sistemleri

DNA molekülünün analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber hemen tüm laboratuvarlarda rutin olarak kullanılan en basit yöntem jel elektroforezidir. Elektroforez işlemi farklı boyutlardaki moleküllerin elektrik yüklü bir ortamda ayrılmaları ve analiz edilmeleri için kullanılan bir tekniktir.

Elektroforetik analizin temeli, moleküllerin elektriksel bir alanda jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

DNA Dizi Analizi Sistemleri

DNA dizi analizi, moleküler genetikte mutasyonu tanımlamak ve tiplendirmek için geliştirilen önemli bir analitik tanı yöntemidir. İncelemeye alınan bir genin baz dizisinin bilinmesi ve bu gende bir mutasyon varsa bunun tanımlanması büyük önem taşır. Mutasyon genelde, bir genel referans diziye göre, bu referans dizide meydana gelen değişim şeklinde tanımlandığından, mutasyon analizinde en iyi yöntem ‘altın standart’ olarak bilinen dizi analizi yöntemidir. DNA dizi analizleri ilk kez 1977 yılında geliştirilen iki teknik sayesinde yapılmaya başlanmıştır. Bunlar, Sanger dideoksi yöntemi ve MaxamGillbert kimyasal degredasyon yöntemidir. Her iki teknik de üç temel basamaktan oluşmaktadır.

• DNA’nın hazırlanması
• Reaksiyonlar
• Yüksek voltajlı jel elektroforezi

Son yıllarda, genom dizileme için klasik otomatik dizileme yöntemlerinde temel pek çok yenilik olmuştur. Teknikte yapılan gelişmelere rağmen klasik otomatik dizileme sınırlılıkları, çok sayıda örneğin dizilenmesi için daha yüksek kapasiteli ve kolay ulaşılabilir teknolojilerin gelişmesini zorunlu kılmıştır

Milyonlarca DNA dizisinin tek bir seferde okunmasını sağlayan yeni nesil teknolojinin gelişmesiyle şimdiye kadar erişilemeyen bir hız ve kapasite ile genoma ilişkin sorulara yanıt bulunmaktadır. Yüksek performanslı bilgisayar biyoinformatik ile birleştiğinde söz konusu teknolojileri kullanan sistemlerin maliyeti de azaltmıştır. Yeni nesil DNA dizileme sistemleriyle yüksek doğrulukla ultra hızlı olarak, dizileme yapılabilmektedir. Bu yöntemle elde edilen bir genom dizisi araştırmacılara başka hiçbir deneysel yöntem ile elde edilemeyecek kadar zengin ve özgün bilgi sağlamaktadır.

Pirodizileme yöntemi esasında bir eş zamanlı dizi analizi yöntemidir, zincir terminasyonu yöntemini baz alır. Bu yöntemde, dizi analizi primerinin uzaması süresince DNA polimeraz enzimi bir dNTP’nin birleşmesini sağlar. Klasik dizi analizinden farklı olarak herhangi bir elektroforez aşamasına, dNTP’lere, floresan işaretli nükleotidlere gerek yoktur. Bir adet dNTP birleştiği zaman, pirofosfat oluşumu, ışık emisyonu ile sonuçlanan lusiferazın katalizlediği bir reaksiyonla birleştirilir. Bu yöntem klasik dizi analizlerindeki gibi bir sekans dizisi oluşturmaz.

Mikroarray Teknolojisi

Biyoinformatik ve moleküler genetik alanındaki ilerlemelere paralel olarak geliştirilen mikroarray teknolojisi tek bir çip üzerinde tüm genomun (DNA) ve ekspresyon ürünlerinin (RNA ve protein) incelenmesi yöntemidir.

2000’li yılların başında, mikroarray teknolojisinin gelişimi, aynı anda binlerce genin ekspresyonunun tayinine imkan vermiştir. Mikroarray teknolojisi, prob DNA’nın (binlerce genin her biri için bir tane) küçük miktarlarını içeren birçok sıralı, kuyucuklu, cam slaytlar olan DNA mikroçipleri ve sonuçları analiz eden bilgisayar programlarını da içeren bir teknolojidir.