Ünite 5: Enterobakteriler

Eşherişya Koli

Eşherişya genusuna ait Escherichia coli (E.coli), E.albertii, E.blattae, E.fergusonii, E.hermanii, E.vulneris olmak üzere 6 tür bulunmaktadır. Bu türlerden en önemlisi olan E.coli, Gram negatif, çomak şeklinde, sporsuz, fakültatif anaerobik ve sahip olduğu flagellası sayesinde hareketli bir bakteridir. E.coli, jenerasyon süresi oldukça kısa olan bir bakteridir. E.coli’deki önemli antijenik yapılar ve özellikler arasında başlıca; somatik O antijeni, flagella antijeni (H), kapsüler antijen (K), enterotoksinler, nörotoksinler, endotoksinler, sitotoksik nekrozan faktör (CNF) bulunmaktadır.

E.coli, hayvanlarda pek çok hastalığa neden olmaktadır ve bu hastalıklar E.coli’nin Enterotoksijenik E.coli (ETEC), Enteropatojenik E.coli (EPEC), Enterohemorajik E.coli (EHEC), Enteroinvaziv E.coli (EIEC) gibi patotipleri tarafından oluşturulur.

Epidemiyoloji

Normal bağırsak flora etkeni olan E.coli’ler dışkı ile saçılmak suretiyle çevreye, yemlere ve sulara bulaşmaktadır. E.coli’nin bulaşması fekal-oral yol (dışkı-ağız) ile olmaktadır. Genelde bağırsaktaki E.coli sayısı bağırsakta bulunan diğer bakteriler ile E.coli’ler arasındaki kompetitif antagonizma ve yeni doğanlarda kolostrum ve süt ile alınan antikorların sağladığı lokal bağışıklık olmak üzere iki biyolojik faktör ile kontrol altında tutulmaktadır. Dışkıların ve altlıkların toplanması, hayvan barınaklarının temiz tutulması, yem ve suyun dışkı ile kontaminasyonunun engellenmesi gibi önlemler alınarak E.coli infeksiyonları kontrol altında tutulabilir.

Laboratuar tanısında ishal durumlarında dışkı, mastitis olgularında süt incelenir. Ölen hayvanlara nekropsi yapılarak lezyonlu organlardan örnek alınmalıdır. Bakteriyolojik tanı koyulurken lezyonlu bölgelerden hazırlanan preparatlar Gram yöntemi ile boyanarak incelendiğinde Gram negatif çomakların görülmesi E.coli’yi düşündürür, ancak kesin teşhis için yeterli değildir. Gönderilen materyallerden E.coli izolasyonu için Kanlı Agar, MacConkey Agar, EMB Agar gibi besiyerlerine ekim yapılır. E.coli, Kanlı Agar’da S tipli kenarları düzgün koloniler oluşturur. Bazı suşları ise hemoliz oluşturur. MacConkey Agar’daki koloni görüntüsü yine S tipi olup rengi pembedir. Oluşan kolonilerden yapılan boyamada Gram negatif çomakların görülmesi E.coli yönünden şüphe uyandırır. E.coli için yapılan biyokimyasal testler arasında; karbonhidrat fermentasyon testleri, indol, Metil Kırmızısı (Metil Red), Voges-Proskauer (VP), Sitrat (Citrate), H2S testi bulunur.

E.coli’nin virulensinin tespiti için hücre kültürleri kullanılır. Bunlar toksijenik suşlar için Vero, Y1, CHO hücre kültürleri, enteropatojenik suşlar için ise Hep-2 ve HeLa hücre kültürleridir. Hücre kültürlerine inokulasyon sonrasında hücrelerin morfolojik değişimleri gözlenerek sonuç değerlendirilir.

Serolojik tanıda; E.coli’nin antijenik yapılarının belirlenmesi amaçlanır. E.coli, serolojik olarak hızlı lam aglütinasyonu tekniğiyle saptanır. Bu teknikte, oluşan koloniler, E.coli suşlarına karşı oluşturulmuş spesifik antiserumlarla lam üzerinde karıştırılır. Aglütinasyon oluşması pozitif reaksiyon olarak kabul edilir. Koloni hangi antiserumlarla aglütinasyon gösterirse, o antijenik yapılara sahiptir.

PCR ile E.coli’ye ait antijenik yapıları ve virülens faktörlerini kodlayan genler belirlenerek moleküler tanı konulur.

Salmonella

Doğada birçok hayvan türünde ve çevresel örneklerde çok yaygın olarak bulunan Salmonellalar, enterobakterilerin genel özelliklerini taşıyan Gram negatif, kısa ve küçük çomaklar tarzında bakterilerdir. Salmonellalar, Salmonella genusuna ait 2 türü ve yaklaşık 3000 serotipi kapsamaktadır. Salmonella türleri S.bongori ve S.enterica’dır. Birçok patojenik bakteriyi içeren S.enterica türü, belirli biyokimyasal testlere ve bakteriyofaj duyarlılıklarına göre değerlendirildiğinde S.enterica subsp. enterica (I), S.enterica subsp. salamae (II), S.enterica subsp. arizonae (IIIa), S.enterica subsp. diarizonae (IIIb), S.enterica subsp. houtenae (IV) ve S.enterica subsp. indica (VI) olmak üzere altı türe ayrılır.

Salmonellanın antijenik yapıları, somatik O antijeni, flagellar H antijeni, yüzeysel antijenler, enterotoksin ve sitotoksinlerdir. Salmonellalar sahip oldukları flagellar antijenin faktörlerine göre monofazik ve difazik olarak ikiye ayrılırlar. Sentezledikleri toksinler arasında endotoksin, enterotoksin ve sitotoksin bulunmaktadır. Endotoksinleri, bağırsak mukozasında harabiyete neden olur ve akut toksemi vakalarından sorumludur. Enterotoksinleri, E.coli’nin labil toksinine benzer ve bağırsak lümenine sıvı ve elektrolit geçişine neden olarak ishal tablosu şekillendirir. Salmonellaların sitotoksinleri ise fiigella toksinine benzer karakterde olup, bağırsak mukozasındaki epitellerin protein sentezini engeller.

Salmonellalar antijenik formüllerine göre tanımlanırken, öncelikle O-somatik antijeni, varsa yüzeysel antijeni sonra da hareketli ise flagellar H antijenleri (Faz-1 ve Faz-2) yazılır.

İnsan ve hayvanlarda infeksiyona neden olan salmonellalar genellikle S.enterica subsp. enterica (I) alttürüne aittir. Salmonellalar, insan ve hayvanlarda genel infeksiyonlara (tifo gibi), gıda zehirlenmelerine (S.Enteritidis, S.Typhimurium) ve bazı özel hastalıklara (abortlar) neden olmaktadır. İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan bazı önemli Salmonella serotipleri, Sayfa 87’de yer alan Tablo 5.2’de gösterilmiştir.

Epidemiyoloji

Kontamine gıda, su, yem hammaddeleri ve infekte hayvanların dışkılarıyla bulaşma söz konusudur. İnfeksiyon canlı salmonellaların oral yolla alınmasıyla şekillenir. Bağışıklığı baskılanmış hayvanlar, yeni doğanlar, stres altındaki hayvanlar infeksiyona daha duyarlıdır. Tüm hayvanlar normal bağırsak florası bozulduğu durumlarda yüksek risk altındadır. Kanatlılarda salmonella bulaşması infekte hayvanların dışkılarıyla olmaktadır. Yem, Paratifo etkenlerinin bulaşmasında önemli bir kaynaktır. Mekanik bulaşmada ise kümesler veya çiftlikler arası gezen ve dezenfeksiyona dikkat etmeyen bireyler, ziyaretçiler, memeliler, yabani kuşlar, kemiriciler ve sinekler önemlidir. Etlerin kontaminasyonu, kesimhanedeki haşlama tanklarında veya organların çıkarımı esnasındaki yırtılmalar sonucunda meydana gelir. Böyle kontamine etlerin iyi pişirilmeden tüketilmesi insanlar için önemli infeksiyon kaynağıdır.

Laboratuar tanısında abort vakalarında, atık fötusa ait organlar, fötal membranlar gönderilir. Kanatlı Salmonellozisinin bakteriyolojik teşhisi için ise yeni ölmüş veya agoni halindeki hayvanlar, serolojik teşhis için de kan veya kan serumu laboratuar numunesi olarak gönderilebilir. Bakteriyolojik tanıda öncelikle, klinik vakalardan gelen numunelerden hazırlanan preparatlar Gram boyanır ve Gram negatif çomakların görülmesi klinik ve nekropsi bulguları göz önünde bulundurularak salmonella infeksiyonu şüphesi uyandırır, ancak bakteriyoskopi teşhis için yeterli değildir.

Paratifo infeksiyonlarında izolasyon identifikasyon prosedürleri değişiklik göstermekle birlikte temelde 4 aşamadan oluşmaktadır. Bunlar selektif olmayan ön zenginleştirme, birincil selektif zenginleştirme, selektif ve ayırıcı katı besiyerlerine ekim, şüpheli kolonilerin doğrulanması ve identifikasyonu için biyokimyasal ve serolojik testlerdir.

Serolojik tanıda, kültür sonrasında oluşan kolonilerin spesifik antiserumlarla bir lam üzerinde karıştırılması ile aglütinasyon reaksiyonu değerlendirilir. Aglütinasyon oluşması pozitif reaksiyonu gösterir. Şüpheli koloniler öncelikle polivalan O ve polivalan H antiserumlarıyla kontrol edilmeli, sonrasında O antijen alt gruplarına ve H antijen fazlarına yönelik antiserumlarla değerlendirmeye gidilmelidir. Salmonella infeksiyon tanısında kullanılan serolojik yöntemler ise hızlı tam kan aglütinasyon, hızlı serum aglütinasyon, tüp aglütinasyon, mikro-aglütinasyon ve ELISA’dır.

Moleküler tanı, gönderilen numunelerden, kültür sonucu elde edilen kolonilerden ve yemlerden yapılabilmektedir. Bu amaçla genellikle kültür yönteminin ön zenginleştirme aşamasından alınan örneklerden salmonella aranması PCR test duyarlılığını artırıcıdır.

Yersinya

Yersinyalar Gram negatif, kokoid çomak şeklinde, sporsuz, kapsülsüz, fakültatif anaerobik bakterilerdir. Kültüre edildiklerinde Kanlı Agar ve MacConkey Agar’da 0,1-1 mm çapında S tipli koloniler oluştururlar. Yersinya genusuna ait Yersinia pestis (Y.pestis), Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica, Y.intermedia, Y.frederiksenii, Y.kristensenii, Y.ruckeri, Y.bercovieri, Y.mollaretii, Y.rohdei, Y.aldovae olmak üzere 11 farklı tür bulunur.

Epidemiyoloji

Y.enterocolitica infeksiyonuna at, domuz, koyun, kedi, köpek, rodentler oldukça duyarlı olmakla beraber bu etken tavşan, çinçila ve maymunlarda da enteritise ve septisemiye yol açmaktadır. Y.pseudotuberculosis, doğal koşullarda rodentlerde ve evcil hayvanlarda görülmektedir. Ancak bakım-besleme eksiklikleri ve mevsimsel değişimler hastalığın oluşmasında etkilidir. Y.pestis ise infekte rodentlerin kediler tarafından yenilmesi suretiyle kedilere bulaşır ve bu infekte kediler insanlar için potansiyel infeksiyon kaynağıdır. Etkenin bulaşmasında vektör olarak pireler de önem taşır.

Laboratuar tanısında; Y.pseudotuberculosis için dışkı ve lenf düğümlerinden yapılan aspirat sıvısı laboratuara numune olarak gönderilir. Y.pestis tanısında ise ödematöz dokulardan ve lenf düğümlerinden aspirat, beyin omurilik sıvısı ve kan örnekleri toplanır. Y.enterocolitica izolasyonu için ise dışkı örneği gönderilir.

Bakteriyolojik tanıda; numunelerden yapılan direkt mikroskobik incelemede Gram negatif çomaklar gözlenir. Yersinia türleri Kanlı Agar, Nutrient Agar ve MacConkey Agar’da ürerler. Y.enterocolitica ve Y.pseudotuberculosis’in dışkıdan izolasyonu için soğuk zenginleştirme prosedürü gerekli olabilir. Haftalık aralıklarla MacConkey Agar ve Yersinia Selektif Besiyerine ekilerek subkültürü yapılır. Y.enterocolitica ve Y.pseudotuberculosis Kanlı Agar’da hemolitik olmayan koloniler oluşturur. Yersinia Selektif Besiyerinde ise ortası koyu kırmızı kenarları ise şeffaf olan koloniler meydana getirirler. İzolasyon sonrası oluşan kolonilerden saf kültür hazırlanarak identifikasyona gidilir. Y. pestis, referans laboratuarlarda yapılan florasan antikor tekniği, bakteriyofaj duyarlılığı ve deney hayvanları (fare, kobay) inokulasyonu ile teşhis edilmektedir.

Serolojik tanıda; bazı referans laboratuarlarda Y.enterocolitica ve Y.pseudotuberculosis’e karşı oluşmuş antikorların saptanmasına yönelik mikroaglütinasyon ve komplement fikzasyon testleri ile ELISA yöntemi uygulanmaktadır.

Moleküler tanıda; Y.pestis, Y.enterocolitica ve Y.pseudotuberculosis’in antijenik ve virulens karakterlerinin genetik düzeyde saptanması PCR yöntemi ile yapılmaktadır.

Diğer Enterobakteriler

Enterobakteri familyasında yer alan diğer önemli bakteri genusları; Şigella, Sitrobakter, Klebsiyella, Enterobakter, Serratya, Hafniya ve Proteus’tur. Tüm bu genuslara ait bakteriler Gram negatif özelliktedir. Şigella çomak tarzında, fakültatif anaerobik, hemoliz oluşturmayan, laktoz negatif, oksidaz negatif olan bir bakteridir. Sitrobakter çomak tarzında, fakültatif anaerobik, hemoliz oluşturmayan, sitratı kullanan bir bakteri genusudur. Hayvanlardaki patojenitesi tartışmalı olan bu etken, mikroflora etkeni olarak kabul edilmekte, su ve topraktan izole edilebilmektedir. Klebsiyella etkenleri çomak şeklinde, hareketsiz, fakültatif anaerobik, laktoz pozitiflerdir. Enterobakter genusu çomak şeklinde, hareketli, fakültatif anaerobik, hemoliz oluşturmayan ve laktoz pozitif bakterileri kapsar. Serratya normal flora etkeni olup toprakta ve suda da bulunurlar. Hafniya çomak şeklinde, hareketli, kapsülsüz, sporsuz bir etken olup en önemli türü Hafnia alvei (H.alvei)’dir. Proteus çomak tarzında, hareketli bir bakteri olup önemli laboratuar kontaminantıdır. Kedi ve köpeklerin kulak iltihapları ve üriner sistem infeksiyonlarından izole edilebilmektedir.

Epidemiyoloji

Şigella, Sitrobakter, Klebsiyella, Enterobakter, Serratya, Hafniya ve Proteus genusları normal flora etkenleridir ve fırsatçı patojen olarak infeksiyona neden olmaktadırlar. Etkenlerle kontaminasyonda dışkının önemi büyüktür.

Bakteriyolojik tanıda; numunelerden direkt bakteriyoskopi yapıldığında Gram negatif çomaklar görülür. Teşhis için etken izolasyonu ve identifikasyonu gereklidir. Şigella, Sitrobakter, Klebsiyella, Enterobakter, Serratya, Hafniya ve Proteus genusları genel besiyerlerine ekim yapıldığında üremektedir. K.pneumonia kolonileri mukoid karakterdedir. S.marcescens ürettiği kırmızı pigmenti (prodigiosin) sayesinde karakteristik kırmızı kolonilerini oluşturur. Yapılan biyokimyasal testler arasında; şeker fermentasyon testleri (glikoz, laktoz, sükroz gibi), indol testi, MR/VP, sitrat, hidrojen sülfit testi, üre testi bulunmaktadır.

Serolojik olarak aglütinasyon testleri bazı bakteriler için yapılabilmektedir. Shigella şüpheli koloniler direkt Shigella-spesifik antiserumlarla test edilir.

Moleküler tanıda; Şigella, Sitrobakter, Klebsiyella, Enterobakter, Serratya, Hafniya ve Proteus izolatları genetik düzeyde PCR ile analiz edilebilir.