Ünite 5: Laboratuvar Gereksinimleri ve Temel Uygulamalar

Viroloji Laboratuvarında Çalışma Koşulları

Viroloji laboratuvarları genel anlamıyla mikrobiyoloji laboratuvarlarının taşıması gereken temel özelliklere sahiptir.

İzolasyon: Viroloji laboratuvarları iyi bir izolasyon özelliğine sahip olmalıdır. Viroloji çalışmalarında yararlanılan en önemli araçlardan birisi hücre kültürleridir. Özellikle mikrobiyel kontaminasyonlardan arındırılmış olarak çalışılması gereken hücre kültürleri, özen gerektiren bir çalışmaya ve çalışma ortamına ihtiyaç duymaktadır. Rutin viroloji laboratuvarları BSL-1 ve BSL-2 düzeyinde yer alır. BSL-1 sınıfı laboratuvarlarda çoğunlukla açık masalarda ve özel bir güvenlik tedbiri gerektirmeyen standart yöntemlerle çalışılır. BSL-2 sınıfı laboratuvarlarda insanlar için risk oluşturabilen etkenler de çalışılabilmektedir. Bu sebeple gerektiğinde kullanılabilecek biyogüvenlik tedbirleri (özel laboratuvar giysileri, atık yönetim sistemi vb) ve tip-2 biyogüvenlik kabinleri bulunur. BSL-3 ve BSL-4 sınıfı laboratuvarlar ise çok tehlikeli, ölümcül seyirli salgınlara yol açabilecek ve egzotik karakterdeki enfeksiyöz etkenlerin çalışılmasına uygun olarak tasarlanmıştır. Sterilizasyon: Biyogüvenlik kabinleri ve küçük odalar tarzında düzenlenmiş mekanlarda bulunan laboratuvar masaları uygun konumda yerleştirilen ultraviyole ışık kaynağı ile strerilize edilir. Ultraviyole ışıkla sterilizasyon aynı zamanda plastik türevi malzemelerin sterilizasyonu için de uygundur.

Dezenfeksiyon – Dekontaminasyon: Bir cisim üzerinde veya bir maddenin içeriğinde bulunan patojen mikroorganizmaların elimine edilmesine yönelik olarak fiziksel ve kimyasal maddelerin uygulanmasına dezenfeksiyon denir. Dezenfeksiyon işleminde dezenfektan adı verilen kimyasal maddeler kullanılır. Dekontaminasyon ifadesi daha geniş bir anlama sahiptir ve kontamine ortamlardaki mikroorganizmaların temizleme, dezenfeksiyon ve sterilizasyon yöntemleriyle elimine edilmesini ifade eder.

Laboratuvar Donanımı: Virusların ve hücre kültürlerinin saklanabilmesi için kullanılan -70 °C veya daha düşük sıcaklık derecelerini sağlayabilecek derin dondurucular viroloji laboratuvarlarının vazgeçilmez donanımları arasındadır. Hücre kültürlerinin uzun süreli saklanmaları ise sıvı azot (-195°C) içerisinde yapılmaktadır.

Temel Cihazlar Ve Malzemeler

Santrifüjler: Santrifüjler, farklı yoğunluklara sahip olan maddelerin yer çekimi etkisiyle ayrıştırılmasını hızlandıran araçlardır. Santrifüjler temel olarak bir rotor, bu rotorun dönmesine olanak sağlayan çevirme mili (şaft) ve dönme gücünü üreten bir motordan oluşmaktadır. Viroloji laboratuvarlarında kullanılan dört tip santrifüj bulunmaktadır. Bunlar; genel amaçlı santrifüjler, soğutmalı santrifüjler, yüksek devirli santrifüjler ve ultrasantrifüjlerdir.

Biyogüvenlik Kabinleri: Viroloji laboratuvarlarında gerek hücre kültürleri gerekse viruslarla yapılan çalışmalarda dış ortamdan kaynaklanabilecek kontaminasyonların engellenmesi esastır. Bu ortamı sağlayabilmek amacıyla biyogüvenlik kabinlerinden yararlanılır. Viroloji laboratuvarlarında en çok kullanılan biyogüvenlik kabinleri Tip 1 (klasik) ve Tip 2 (mikrobiyolojik) biyogüvenlik kabinleridir. Tip-1 biyogüvenlik kabinleri çalışma ortamını ve yapılan işi kontaminasyonlardan korurken, Tip-2 biyogüvenlik kabinleri aynı zamanda çalışan kişiyi ve çevreyi de çalışılan materyalden kaynaklanabilecek risklere karşı korumaktadır. Yüksek güvenlik şartları sağlayan Tip-3 ve Tip-4 biyogüvenlik kabinleri ise özellikle egzotik ve zoonotik hastalık etkenlerinin çalışılması sırasında gereklidir.

Mikroskoplar: Viroloji laboratuvarlarındaki temel uygulamalardan birisi olan hücre kültürlerinin incelenmesi invert mikroskoplarda yapılır. invert ışık mikroskoplarında ışık kaynağı üstte, objektif alttadır. Bunun dışında hücrelerin içyapıları ve viruslar gibi çok küçük partikülleri görüntülemek amacıyla kullanılan elektron mikroskop da viroloji laboratuvarlarında kullanım alanı bulan donanımlardır.

Derin Dondurucular: Virusların kısa süreli muhafazası için -20 °C kapasiteli derin dondurucular yeterlidir. Hücre kültürleri ve virusların uzun süreli saklanabilmesi amacıyla -70 °C’ sıcaklığa kadar soğutma kapasitesine sahip olan derin donduruculara ihtiyaç vardır.

Homojenizatörler: Katı materyalleri homojen hale getirmek amacıyla havan ve doku parçalayıcı kullanılır. Süspansiyon halindeki partiküllerin homojenizasyonunda ise ses dalgaları yayarak çalışan ultrasonik homojenizatörden yararlanılır.

Karıştırıcılar ve Çalkalayıcılar: Deney tüpleri veya değişik büyüklükteki taşıyıcıların içinde bulunan sıvı haldeki materyallerin (eriyik, süspansiyon vb) karıştırılması amacıyla en yaygın olarak kullanılan araçlar tüp çalkalayıcı (vorteks), orbital çalkalayıcı ve manyetik karıştırıcılardır.

Su Banyosu: Kullanılacak biyolojik bir maddenin optimum sıcaklık değerlerine ısıtılması, belirli sıcaklık değerlerinde belirli sürelerde inkübe edilebilmesi veya dondurulmuş biyolojik maddelerin hızlı çözülebilmesi amacıyla su banyoları kullanılır. Soğutmalı su banyoları ve kaynatma özellikli su banyoları (benmari) da mevcuttur.

İnkübatörler: Viroloji laboratuvarlarında çoğunlukla karbondioksitli inkübatörler kullanılır. ‹nkübatör iç ortamındaki havanın genellikle % 5 CO2 içermesi istenir. Böylece kültür ortamında kullanılan vasatların pH değerleri dengede tutulabilmektedir.

Filtrasyon Sistemleri: Hücre kültürlerinin hazırlanması ve devam ettirilmesinde kullanılan vasatlar ve biyolojik ürünler filtrasyonla sterilize edilir. Bu işlemler sırasında 220 nm por büyüklüğüne sahip olan filtreler kullanılır.

Otoklav ve Sterilizatörler: Otoklavlar, buhar basıncı altında yüksek ısı uygulayarak sterilizasyon sağlayan cihazlardır. Otoklavlar katı (cam, metal vb) ve sıvı materyallerin sterilizasyonu amacıyla kullanılabilir. Bu amaçla en sık kullanılan otoklavlama koşulları 121°C sıcaklıkta 1 atmosfer basınç altında 15-20 dk süreyle uygulanan işlemlerdir. Sterilizatörler ise yüksek sıcaklıkta kuru hava uygulanarak sterilizasyonun sağlandığı cihazlardır.

Temel Uygulamalar

Pipet Kullanımı: Pipetler sıvı haldeki maddelerin alınması veya karıştırılmasına yarayan aparatlardır. Serolojik cam pipetler, pastör pipetleri ve otomatik pipetler en çok kullanılan pipet çeşitleridir. Pipet ile ölçüm yaparken menisküs çizgisi takip edilmelidir. Cam pipet kullanılırken ağız ile pipetasyon yapılmamalıdır.

Sterilizasyon: Sterilizasyon, belirli bir ortamın veya bir materyalin tüm mikroorganizmalardan arındırılması anlamına gelir. Bu amaçla ya ortamdaki tüm mikroorganizmaların öldürülmesi veya mikroorganizmaların ortamdan ayrıştırılması uygulanabilir. Sterilizasyonu olarak kuru sıcak hava ile sterilizasyon cam malzemeler için uygulanabilir. Nemli sıcak hava ile sterilizasyon yönteminde otoklav kullanılmaktadır. Yapısı sıcaklık uygulamasından etkilenmeyen değişik sıvı materyaller ile cam ve metal malzemeler otoklavda sterilize edilebilir. Otoklav sterilizasyonunda dikkat edilmesi gereken bazı durumlar vardır. Bunlar;

• Sterilize edilecek malzemelerin uygun şekilde paketlenmesi gerekir. Bu amaçla kağıt veya polipropilen malzemeden üretilmiş otoklav torbaları kullanılır
• Şişeler ve şişe içerisinde sterilize edilecek sıvı malzemeler söz konusu ise; şişe kapağı tam kapatılmadan otoklava konulmalıdır. Otoklavlama işlemi bittikten sonra bu kapaklar sıkılmalıdır.
• Sterilize edilecek malzemeye uygun sıcaklık ve süre değerleri belirlenmelidir.
• Malzemeler otoklava yerleştirilmeden önce mutlaka üzerine otoklav bandı yapıştırılmalıdır
• Organik bileşik içermeyen vasatlar (örneğin; PBS) otoklavda steril edilebilir. Ancak hücre kültürü vasatları ve diğer organik bileşikler içeren vasatlar otoklavla steril edilmemelidir.
• Kontamine ve temiz materyaller birlikte steril edilmemelidir.
• Sıvı materyaller ile katı malzemeler bir arada steril edilmemelidir. Elektronik donanımlı cihazlarda genellikle farklı nitelikteki malzemeler için uygulanan farklı programlar hazırlanmıştır. Yapılacak uygulama için doğru programların seçilmesine dikkat edilmelidir.

Bunlar dışında ışınlama ile sterilizasyon yapılabilir. Ayrıca gaz ile sterilizasyon işlemlerinde sıklıkla başvurulan madde etilen oksit gazıdır. Isıl işlemlerden olumsuz etkilenen hücre kültürü vasatları vb sıvı materyallerin sterilizasyonunda filtrasyon yönteminden yararlanılır. Değişik por büyüklüklerine (0,2µm; 0,45µm; 0,6µm) sahip membran filtreler bulunmaktadır. Sterilizasyon uygulamalarında 0,2µm por büyüklüğüne sahip olan filtreler tercih edilir.

Filtrasyonla sterilizasyon işleminde aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir:

• Büyük miktardaki sıvıların sterilizasyonunda kullanılan filtrasyon sistemi öncelikle otoklavda steril edilmelidir.
• Filtre edilecek çözelti mutlaka iyice çözünmüş olmalıdır.
• Filtre edilecek sıvı içerisinde kaba partiküller varsa santrifüjleme veya ön filtrasyon (0,45µm veya 0,6µm) işlemi ile elimine edilmelidir.
• Membran filtreler tek kullanımlıktır. Tekrar kullanılmamalıdır.
• Filtre edilen materyal daha önce steril edilmiş kaplara alınmalıdır.
• Filtrasyonla yapılan sterilizasyon işleminde sadece büyüklüğü 0,2µm’den daha büyük olan partiküllerin tutulması nedeniyle virusların elimine edilemediği unutulmamalıdır.

Santrifüjleme İşlemi: Santrifüjler, farklı yoğunluklara sahip olan moleküllerin yer çekimi etkisiyle ayrıştı rılmasını hızlandırmak amacıyla kullanılır. Santrifüj sistemi merkezkaç kuvveti ile çalışır. Santrifüj işlemi sonrasında elde edilen çökeltiye sediment (veya pelet), üstte kalan sıvı kısma ise süpernatant adı verilir.