TIBBİ CİHAZ VE MALZEMELER Dersi İleri Moleküler Tanı, Tektik Cihaz ve Malzemeleri soru detayı:

CEVAP:

Pirodizileme reaksiyon basamakları şu şekildedir:

 1. DNA segmenti amplifiye edilir ve dizi pirodizilemede kalıp olarak kullanılmak üzere biyotinlenir. Denatürasyondan sonra biyotinlenmiş tek zincirli PCR amplikonu izole edilerek sekanslayıcı primer ile hibridize olması sağlanır.

 2. Hibridize olmuş primer ve kalıp zincir, DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lusiferaz, apiraz, adenozin 5’ fosfosülfat (APS) ve lusiferin ile inkübe edilir. 

3. İlk deoksiribonükleotid trifosfat (dNTP) reaksiyona katılır. DNA polimeraz sekanslayıcı primere dNTP katılımını katalizler. Kalıp diziye her dNTP inkorporasyonu, katılım sayısıyla orantılı biçimde pirofosfat (PPi) salınımına sebep olur. 

4. ATP sülfürilaz PPi’yi APS’nin varlığında ATP’ye dönüştürür. Bu ATP, lusiferinin oksilusiferine dönüşümünü tetikleyerek ortaya çıkan ATP oranına bağlı görünür dalga boyunda ışık üretir. Lusiferaz ile üretilen ışık sensörler tarafından tespit edilir ve bilgisayar programında pik olarak değerlendirilir. Her bir pikin (ışık sinyalinin) yüksekliği inkorpore olan nükleotid sayısıyla orantılıdır. 

5. Apiraz ortamda bulunan inkorpore olmamış nükleotidleri ve ATP’yi parçalar. Parçalanma tamamlandığında diğer bir nükleotid ilave edilir. dNTP’lerin ilavesi seri hâlinde devam ettirilir. Proses devam ettikçe, komplementer DNA dizisi uzar ve nükleotid dizisi program aracılığıyla sinyal piklerinden belirlenir.