DNA örneği kan, tükürük, saç kökü ve amniyon sıvısı gibi içinde çekirdekli hücre bulunduran her türlü materyalden elde edilebilir.

DNA ve RNA izolasyonu manuel yöntemlerle yapılabildiği gibi otomatize sistemler de kullanılmaktadır. İzolasyon üç temel basamak içerir: 

1. Hücrenin paralanması ve DNA ya da RNA molekülünün açığa çıkartılması,

2. DNA’nın protein kompleksinden ayrılması ve çözünür hâle getirilmesi, 

3. Çeşitli fiziksel ya da kimyasal yöntemler ile DNA ya da RNA’nın proteinler ve diğer makro moleküllerden ayrılması.

Bu basamaklar manuel olarak uygun kimyasallar ve kitlerle yapılabileceği gibi otomatize kapalı sistemler ile de gerçekleştirilebilir.

İzolasyon cihazlarının hemen hepsinde kapalı bir kabin içinde uygun miktarda kimyasalı pipetleyen otomatik bir kol ile kimyasalı uygun sürede ve uygun ısıda örnekle muameleye olanak sağlayan ve eğer gerekliyse pipetaj ya da vibrasyon yapan tabla sistemleri kullanılır. Tüm bu sistem geliştirilmiş özel bilgisayar programı ile kontrol edilir. İzolasyonun otomatize olması hem daha kısa sürede daha çok örneğin izolasyonuna imkân verir hem de kontaminasyon (bulaşma) riskini en aza indirir. Kontaminasyon hem elde edilmek istenen örneğe bir başka materyalin bulaşmaması hem de izolasyonu yapan laboratuvar çalışanına örnekten herhangi bir patojen bulaşmamasını ifade eder. Ayrıca kapalı otomatize sistemler insan müdahalesini en aza indirerek standardizasyonu yükseltir.

Özgün bir DNA örneği üzerinde moleküler analizlerin yapılabilmesi için DNA molekülünün istenen kısmının çoğaltılması gerekir. İn vivo koşullarda DNA molekülü replikasyon ile çoğalır. DNA sarmalının açılarak iki atasal zincirin karşısına yeni zincirlerin sentezlenmesi replikasyon olarak adlandırılır. Replikasyon hücrede bölünmeyi takiben her yavru hücreye özdeş genetik materyal dağılmasını sağlar. DNA molekülü in vitro koşullarda polimeraz zincir reaksiyonu adı verilen bir dizi işlem ile çoğaltılır.

PCR yöntemi, avantajları nedeniyle moleküler biyoloji, tıp, adli tıp, arkeoloji gibi pek çok farklı alanda uygulanabilen bir yöntem olmuştur. PCR ile çok az sayıda hücre içeren değişik materyallerden elde edilen bir mg’dan daha az DNA materyalinden kısa bir süre içinde çok miktarda DNA kopyası elde edilebilir.

PCR yöntemi kısaca bir gen ya da DNA bölgesinin, bu hedef bölgenin uç bölgelerine bağlanan oligonükleotit primerler aracılığıyla bir dizi replikasyon geçirerek kendisini çoğaltması işlemidir.

PCR’nin gerçekleşebilmesi için ortamda, çoğaltılmak istenen DNA fragmenti, iki adet tek dallı oligonükleotit (5’ ve 3’ primerleri) ve bunlara ek olarak ısıya dayanıklı Taq DNA polimeraz enzimi, uygun deoksiribonükleotit trifosfatlar (dNTP karışımı), bir tampon ve Mg+2 tuz solüsyonlarının bulunması gerekir. Termostabil DNA polimerazlar ve farklı sıcaklık derecelerini istenilen süreler için otomatik olarak ayarlayabilen PCR aletlerinin (thermal cycler) kullanıma sunulması, PCR’ın verimi ve kullanımında önemli gelişmelere yol açmıştır.

Reaksiyondaki her döngü üç evreden oluşmaktadır. Bu evreler; denatürasyon, primer bağlanması (annealing) ve primerlerin uzaması (extension) evreleridir (Resim 3.3). Bir döngü 3-5 dakika sürer ve 20-30 kez tekrarlanır. Bir döngü sonunda sentezlenen ürün öncekinin iki katı kadardır (Resim 3.4). Döngü sayısı n olarak kabul edilirse 2n çoğaltılmış DNA miktarını verir. Yaklaşık 2- 3 saat süren 20 döngü sonunda, 1.048.576, 30 döngü (228) sonunda ise 270.000.000 amplifikasyon ürünü elde edilir.

Denatürasyon Evresi: Çoğaltılması istenen DNA molekülü, 95oC’de 30 sn. ya da 97oC’de 15 sn. tutularak denatüre edilip tek dal hâline getirilir.

Primer Bağlanması (Annealing) Evresi: Primer adı verilen ve hedef DNA bölgesi için spesifik olan 18-24 baz uzunluğundaki oligonükleotid, denatürasyon sonucu oluşan DNA tek dalındaki kendine komplementer olan nükleotid dizisine bağlanır. Primerlerin bağlanması için ortam ısısı 40-60oC’ye düşürülür.

Primerlerin Uzatılması (Extension) Evresi: Bağlanma tamamlandıktan sonra primer hibritleştiği tek dalın karşılığını sentezler. Bu sentez için termostabil özelliği olan ve Thermus aquaticus adlı bakteriden elde edilen Taq polimeraz enzimi kullanılır. Bu enzim PCR’la DNA sentezi için gerekli olan yüksek optimum ısıya (Topt) sahiptir. Taq polimeraz 72oC sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılmaktadır.

PCR ile elde edilen amplifikasyon ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit bilgi elde edilebilir: 

1. Hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi 

2. Hedef DNA ya da RNA’nın miktarının belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün miktarının ölçülmesi 

3. Dizi analizi

Çoğaltılmış ürünlerin saptanması ve doğrulanması için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Bu yöntemler arasında en basit ve genel olanı elektroforezdir. Agaroz ya da poliakrilamid jellerde, bir floresan boya olan ve DNA ipliklerinin arasına giren, etidyum bromür (EtBr) boyaması ile ürünler görülür. Boyamadan sonra DNA, jelde bir UV transillüminatörden yararlanılarak görülebilir hâle gelir. Boyutu bilinen marker DNA’lar ve kontrol PCR ürünleri de aynı elektroforez jeline uygulanır, böylece amplifikasyon ürününün boyutu hakkında bilgi edinilir. 

Günümüzde PCR yöntemi mutasyonların tanımlanması, prenatal tanı, adli tıpa ilişkin DNA dizi analizleri, bakteriyel ve viral infeksiyonların taranması ile genomik DNA dizi analizi çalışmaları gibi işlemlerde rutin olarak kullanılmaktadır.

Amaca göre geliştirilmiş; nested, reverse transkripsiyon, touchdown, multipleks ve eş zamanlı gibi temelde PCR tekniğine dayanan farklı PCR çeşitleri bulunmaktadır.

 İç içe (Nested) PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumunu engellemek ve PCR tekniğinin spesifikliğini arttırmak için kullanılan bir PCR yöntemidir. Bu PCR metodunda iki farklı set primer çifti kullanılarak iki PCR işlemi yapılır. İlk PCR işleminde iki adet dış primerler kullanılır ve hedef molekül üzerinde uzun bir bölgenin amplifikasyonu yapılır. İkinci PCR işleminde ilk PCR sonucunda elde edilen DNA dizisi üzerinde iç primerler kullanılarak yeniden çoğaltma işlemi yapılır. İç primerlerin çoğalttığı DNA parçası, dış primerlerin çoğalttığı DNA parçasının içerisinde yer alır ve istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün ürünler elde edilir.

Ters (Reverse) Transkripsiyon PCR (RT-PCR); Rekombinant DNA teknolojisinde bazı mutasyonların analizi DNA üzerinden değil RNA üzerinden yapılmaktadır. RNA analizlerinin DNA’dan farkı yalnızca ekzon baz dizilerine sahip olmaları ve protein ekspresyonu çalışmalarında kullanılabilmeleridir. Bu yöntemde önce mRNA’dan reverse transkriptaz enzimi yardımıyla cDNA sentezlenir. Sonra cDNA’nın PCR ile çoğaltılması gerçekleşir. Bu aşamadan sonra pek çok farklı analiz yöntemiyle aranan marker saptanabilir.

Bu PCR yönteminde optimal primer bağlanma derecesini belirlemek amacıyla başlangıçta primer bağlanma sıcaklıkları yüksek tutulup sikluslar arasında 1-2°C düşürülerek uygun sıcaklık derecesi belirlenir. Daha sonraki amplifikasyon siklusları bu sıcaklıkta tamamlanarak hedef bölge çoğaltılmaktadır.

 Çoklu (multipleks) PCR, aynı DNA kalıbı kullanılarak çok sayıda gen veya ürününün birden fazla primer seti kullanılarak çoğaltılması işlemidir.

Higuchi ve arkadaşları tarafından geliştirilen eş zamanlı PCR’ın temel amacı, çok düşük miktarda olsa bile bir örnekteki spesifik nükleik asit dizilerini kesin şekilde ayırmak ve ölçmektir. PCR’ın, modern floresan kimyasallarla birleşmesi ve amplifikasyonun reaksiyon boyunca izlenmesi eş zamanlı PCR’ın temelidir. Eş zamanlı PCR’da bir örnekteki spesifik bir hedef dizi amplifiye olur ve sonrasında floresan teknolojisi ile amplifikasyonun ilerleyişi görüntülenir. Eş zamanlı PCR’ın kullanım alanları arasında, biyolojik örneklerden elde edilen DNA’nın kopya sayısını ve mRNA düzeyini kantitatif olarak belirleme, SNP analizi, DNA hasarı ve metilasyon tayini, kromozom bozukluklarının ve patojenlerin belirlenmesi yer almaktadır

Eş zamanlı PCR sistemi klasik PCR kullanımına göre pek çok avantaj ve dezavantaja sahiptir. Bunlar: 

Avantajları: 

• Yöntemin en önemli avantajları arasında hassas, verimli, hızlı ve kontaminasyon riskinin düşük olması sayılabilir. 

• Klasik PCR belirli sayıda çevrimden sonra ölçüme izin verirken eş zamanlı PCR veriyi eksponansiyel büyüme fazında elde eder. 

• Raportör floresan sinyalindeki artış doğrudan üretilen PCR ürün miktarıyla orantılıdır. 

• Hedef sekansı tespit eden dinamik aralık oldukça geniştir. 

• PCR sonrası ek işlemlere ihtiyaç duymaz.

 • Duyarlılık başlangıç materyalindeki sadece 2 katlık bir değişime kadar düşürülebilmektedir.

Dezavantajları:

• Amplikon boyutu sistem açılmaksızın takip edilememektedir.

• Mevcut sistemler multipleks yetkinliğini sınırlandırmaktadır.
• Bazı sistemler florejenik kimyasallarla uyumsuzluk göstermektedir. 

• Kullanılan teknoloji, kalite yetkinlik ve kontrol düzenlemeleriyle denetlenirse güvenli sonuçlar vermektedir.

• Standardize edilmiş analiz sistemleri ise her yeni uygulamada optimizasyona ve validasyona ihtiyaç duyar. Aksi hâlde eş zamanlı PCR sistemi oldukça fazla miktarda ancak doğru olmayan veri sunacaktır.

Amplifikasyon sürecini göstermek için farklı boya ve problar kullanılmaktadır. Bunlar: 

Dizi spesifik olmayan floresan boyalar: Bu tür boyalar DNA molekülünün tamamına bağlanabilen boyalardır. Sıklıkla kullanılan SYBR Green I boyası, çift sarmallı DNA’ya bağlanarak floresan sinyallerin artmasını sağlar ve genellikle gen dozajını belirlemek için kullanılır.

Dizi spesifik floresan problar: Hedef diziye özgül ve floroforlarla işaretli problardır. Spesifik DNA dizisi mevcut ise reaksiyona katılırlar. Dizi spesifik problar hibridizasyon ve hidroliz problarını içerir.

Hidroliz probları (TaqMan): Taq polimerazın 5’ – 3’ nükleaz aktivitesinden yararlanan prob sistemidir. Mutasyon tayini, PCR amplifikasyonu sonrası iki alele özgül raportör boyanın sinyal yoğunluğunun ölçülmesiyle yapılır. Yöntemin esası, 5’ ve 3’ uçlarından florofor maddelerle işaretli prob kullanılmasına dayanır. Probun 5’ ucunda raportör florofor, 3’ ucunda ise baskılayıcı florofor bulunmaktadır. Prob – hedef DNA molekülü arasındaki hibridizasyon devam ettiği sürece raportör floroforun sinyal oluşturması, 3’ uçtaki baskılayıcı florofor tarafından engellenmektedir. Primerlerin hedef DNA’ya bağlanmasıyla başlayan primer uzaması, probun bağlandığı noktaya kadar geldiğinde, sentezin devam edebilmesi için Taq DNA polimeraz enzimi 5’ – 3’ nükleaz aktivitesini kullanarak probu 5’ uçtan yıkmaya başlar. Böylece raportör florofor serbest hâle geçer ve sinyal oluşturur. Her döngüde meydana gelen PCR ürünü miktarına paralel olarak sinyal şiddeti de artar .

Moleküler İşaret Fenerleri (Molecular Beacons): TaqMan probunun geliştirilmiş şekline moleküler işaret feneri (molecular beacons) adı verilmiştir. TaqMan probundaki oligonükleotidlerin orta kısmındaki spesifik bölgelere ek olarak, probun 5’ ve 3’ uçlarında komplementer sekanslar bulunur. Bu sekansların görevi probun uçlarının kıvrılarak saç tokası şeklini almasını sağlamaktır. Böylece quencer ve raportörün birbirine ışığın emisyonunu önleyecek kadar yakınlaşması garantilenir.

Ticari olarak geliştirilmiş eş zamanlı PCR sistemlerine örnek olarak ABI Prism 7000 (Applied Biosystem), iCycler iQ (Bio-Rad), LightCycler (Roche) ve Rotor-Gene (Qiagen) verilebilir

DNA molekülünün analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber hemen tüm laboratuvarlarda rutin olarak kullanılan en basit yöntem jel elektroforezidir. Elektroforez işlemi farklı boyutlardaki moleküllerin elektrik yüklü bir ortamda ayrılmaları ve analiz edilmeleri için kullanılan bir tekniktir. Elektroforetik analizin temeli, moleküllerin elektriksel bir alanda jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

Elektroforez işleminin türü ayrılması istenen molekülün özelliğine ya da büyüklüğüne göre değişir. Örneğin işlem DNA, RNA ya da protein için farklı jel konsantrasyonu ve akım uygulaması gerektirir. 5-500 baz çifti uzunlukta DNA parçaları ve RNA moleküllerinin ayrımı için poliakrilamid jeller kullanlırken daha büyük DNA parçaları için agaroz jeller tercih edilmektedir. Agaroz jeller için yatay elektroforez tankları ile kullanılırken poliakrilamid jeller dikey sistemlerde uygulanır. Çeşitli boyama yöntemleri uygulanarak agaroz ya da poliakrilamid jelde yürütülen nükleik asit ya da protein UV transilluminatör gibi sistemlerle görüntülenebilir hâle getirilir. Örneğin agaroz jel elektroforez yönteminde genellikle DNA molekülüne bağlanan etidyum bromür kullanılmaktadır .

DNA dizi analizi, moleküler genetikte mutasyonu tanımlamak ve tiplendirmek için geliştirilen önemli bir analitik tanı yöntemidir. İncelemeye alınan bir genin baz dizisinin bilinmesi ve bu gende bir mutasyon varsa bunun tanımlanması büyük önem taşır. Mutasyon genelde, bir genel referans diziye göre, bu referans dizide meydana gelen değişim şeklinde tanımlandığından, mutasyon analizinde en iyi yöntem ‘altın standart’ olarak bilinen dizi analizi yöntemidir. DNA dizi analizleri ilk kez 1977 yılında geliştirilen iki teknik sayesinde yapılmaya başlanmıştır. Bunlar, Sanger dideoksi yöntemi ve Maxam-Gillbert kimyasal degredasyon yöntemidir. Her iki teknik de üç temel basamaktan oluşmaktadır. 

• DNA’nın hazırlanması

 • Reaksiyonlar 

• Yüksek voltajlı jel elektroforezi

Her iki analiz sırasında da temel fark DNA fragmentlerinin üretilme biçiminden kaynaklanır. Jel elektroforezi yüksek çözürnürlükteki DNA moleküllerini ayrıştırdığı için her iki metotta da kullanılır. Sanger dizi analizi yöntemi dideoksi ya da zincir sonlanması reaksiyonları olarak da bilinir. Tehlikeli kimyasallardan uzak ve daha hızlı bir yöntem olduğundan Maxam-Gilbert yöntemine göre daha çok tercih edilir.

Otomatize sistemlerde Sanger’in enzimatik DNA sentezine dayanan zincir sonlanma yöntemi kullanılmaktadır. Otomatik DNA dizi analiz cihazları temel olarak, sistemi kontrol eden yazılımların bulunduğu bilgisayar ile bu programların yönettiği elektroforez sistemini içerir. Elektroforetik ünitelerde bulunan lazer ışık kaynağı ile monokromatik bir ışık oluşturulur. Örnek DNA’nın bulunduğu jel matriks bu monokromatik ışık ile taranır. Elektroforez süresince DNA’ya bağlanan floresan boya ışık ile taranan bölgeye geldiğinde uyarılır. Uyarılan boya kendi için karakteristik olan dalga boyunda ışığı geri yansıtır. Yansıyan bu ışık demeti bir detektör tarafından kaydedilir. Kaydedilen veriler bilgisayar programları ile değerlendirilerek sonuçlar grafiksel ya da matematiksel olarak bilgisayar ekranına aktarılır

Her uygulayıcı farklı yaklaşımlar kullansa da yeni nesil dizileme teknolojilerinin klasik dizilemeden temel farkı, büyük ölçekte paralel sekanslama yapabilmek için dizileme yapılan örneğin ve adaptör dizilerinin pikolitre hacimlerde bir taşıyıcı yüzeye bağlanarak reaksiyonun meydana getirilmesidir. Milyonlarca DNA dizisinin tek bir seferde okunmasını sağlayan yeni nesil teknolojinin gelişmesiyle şimdiye kadar erişilemeyen bir hız ve kapasite ile genoma ilişkin sorulara yanıt bulunmaktadır. Yüksek performanslı bilgisayar biyoinformatik ile birleştiğinde söz konusu teknolojileri kullanan sistemlerin maliyeti de azaltmıştır. Yeni nesil dizileme ile DNA’da meydana gelen dengeli veya dengesiz yeniden düzenlenmeler, genomdaki tüm mutasyonlar ve kopya sayısı değişiklikleri çok kısa sürede saptanabilir. Bu teknoloji, genetik/epigenetik düzenleyici ağların, kromatin yapısı, nükleer yapılanma ve genom varyasyonları hakkındaki bilgi üretimini sağlayan önemli bir araç olmuştur. Yeni nesil DNA dizileme sistemleriyle yüksek doğrulukla ultra hızlı olarak, dizileme yapılabilmektedir. Bu yöntemle elde edilen bir genom dizisi araştırmacılara başka hiçbir deneysel yöntem ile elde edilemeyecek kadar zengin ve özgün bilgi sağlamaktadır. 

Yeni nesil dizileme ile genom hakkında şimdiye kadar elde edebildiğimizin çok ötesinde yeni bilgi ve yaklaşımlar elde edilmektedir. Ancak yöntemin kendi doğasında var olan çok sayıda art arda kısa okuma yapılması önemli bir problemdir. Okuma uzunluğu ve hata oranı konusu hâlâ geliştirilmektedir. Bununla birlikte bu kadar çok bilginin analizi, depo1anması ve değerlendirmesinde büyük zorluklarla karşılaşılmaktadır. Yeni nesil dizileme teknolojisinin başarılı ve verimli kullanılması için gelişmiş biyoinformatik analiz araçlarına ve elde edilen verileri anlamlandıracak bu alanda yetişmiş bilim insanlarına ihtiyaç duyulmaktadır.

Pirodizileme yöntemi esasında bir eş zamanlı dizi analizi yöntemidir, zincir terminasyonu yöntemini baz alır. Bu yöntemde, dizi analizi primerinin uzaması süresince DNA polimeraz enzimi bir dNTP’nin birleşmesini sağlar. Klasik dizi analizinden farklı olarak herhangi bir elektroforez aşamasına, dNTP’lere, floresan işaretli nükleotidlere gerek yoktur. Bir adet dNTP birleştiği zaman, pirofosfat oluşumu, ışık emisyonu ile sonuçlanan lusiferazın katalizlediği bir reaksiyonla birleştirilir. Bu yöntem klasik dizi analizlerindeki gibi bir sekans dizisi oluşturmaz. Pirodizileme işlemi, farklı firmalar tarafından geliştirilmiş olan otomatize sistemler ve bu sistemlerde elde edilen verilerin analizinin yapılmasını sağlayan yazılımları kullanarak yapılmaktadır.

Pirodizileme reaksiyon basamakları şu şekildedir:

 1. DNA segmenti amplifiye edilir ve dizi pirodizilemede kalıp olarak kullanılmak üzere biyotinlenir. Denatürasyondan sonra biyotinlenmiş tek zincirli PCR amplikonu izole edilerek sekanslayıcı primer ile hibridize olması sağlanır.

 2. Hibridize olmuş primer ve kalıp zincir, DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lusiferaz, apiraz, adenozin 5’ fosfosülfat (APS) ve lusiferin ile inkübe edilir. 

3. İlk deoksiribonükleotid trifosfat (dNTP) reaksiyona katılır. DNA polimeraz sekanslayıcı primere dNTP katılımını katalizler. Kalıp diziye her dNTP inkorporasyonu, katılım sayısıyla orantılı biçimde pirofosfat (PPi) salınımına sebep olur. 

4. ATP sülfürilaz PPi’yi APS’nin varlığında ATP’ye dönüştürür. Bu ATP, lusiferinin oksilusiferine dönüşümünü tetikleyerek ortaya çıkan ATP oranına bağlı görünür dalga boyunda ışık üretir. Lusiferaz ile üretilen ışık sensörler tarafından tespit edilir ve bilgisayar programında pik olarak değerlendirilir. Her bir pikin (ışık sinyalinin) yüksekliği inkorpore olan nükleotid sayısıyla orantılıdır. 

5. Apiraz ortamda bulunan inkorpore olmamış nükleotidleri ve ATP’yi parçalar. Parçalanma tamamlandığında diğer bir nükleotid ilave edilir. dNTP’lerin ilavesi seri hâlinde devam ettirilir. Proses devam ettikçe, komplementer DNA dizisi uzar ve nükleotid dizisi program aracılığıyla sinyal piklerinden belirlenir.

Katı ve sıvı faz olmak üzere 2 farklı pirodizileme yaklaşımı vardır. Katı fazlı sistem, nükleotid ilavelerinin yapıldığı aralıklarda komplementer diziye dâhil olmamış dNTP’lerin ve sülfürilaz etkinliğinden sonuçlanan ATP’nin uzaklaştırılması için kalıp materyalin yıkanması gerektirir. Ek olarak bu yaklaşımda sinyal kaybının engellenmesi için kalıp materyal manyetik bilye gibi bir katı komponente bağlı olmalıdır. Sıvı faz dizilemede ise yıkama basamaklarını elimine etmek için apiraz gibi nükleotid parçalayıcı bir enzim eklenir. Reaksiyona girmemiş nükleotidler ve üretilen ATP enzim tarafından parçalanır.

Sistem epigenetik, veteriner bilimi, popülasyon genetiği, farmakogenetik, adli tıp bilimi, kanser araştırmaları, evrimsel inceleme çalışmalarında geniş kullanım alanına sahiptir. 

Pirodizileme sisteminin diğer dizi analizi yöntemlerine göre avantaj ve dezavantajları şöyle özetlenebilir:

 Avantajları:

 • Metod çok örnekli işlemler için kolaylıkla adapte edilebilir. 

• Geleneksel metodlarla kıyaslandığında maliyet daha efektiftir. 

• Sekanslama reaksiyonları oda sıcaklığında ve fizyolojik pH’ta gerçekleşir. 

• Sinyal yakalanması yaklaşık 2 dakikalık çevrimlerledir. 

• Etiketlenmiş primerlere, nükleotidlere ve jel elektroforezine olan ihtiyacı kaldırır.

 • Kısa zincirler oldukça verimli sekanslanabilir: Sinyal-gürültü oranı 40 çevrimden sonra bile oldukça yüksek kalabilmektedir. 

• Düşük frekanslarda bulunsa bile allel kantifikasyonu yapılabilir. 

• Bilinmeyen sekans varyantlarını tespit edebilir. 

Dezavantajları: 

• Katı faz uygulamasındaki her nükleotid ilavesinde yapılan yıkama materyal kaybına sebep olduğu için sinyal kalitesini düşürür. 

• Sıvı faz uygulamasındaki apirazın etkinliği ilerleyen döngülerde ara maddelerin birikmesi sebebiyle azalır. 

• Sıvı faz uygulamasındaki apiraz ve DNA arasında spesifk olmayan etkileşim gözlenir ve bu durum nükleotid degrede edici aktivitenin kaybına yol açar. 

• Homopolimerik bölgelerde 5’ten daha fazla aynı ardı sıralı nükleotidinin korporasyonunu takiben oluşan salınım lineer olmamasından dolayı diziye katılan nükleotidlerin doğru sayısının tespiti zorlaşır. 

• PPi ile gerçekleşecek kontaminasyon sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde düşürür. Tamamlanmamış nükleotid inkorporasyonları da arka plan sinyalini önemli ölçüde arttırır.

 • Ekzonükleaz içermeyen DNA polimerazın kullanımından dolayı nükleotid inkorporasyon güvenirliği yeterince yüksek değildir. 

• Uzun sekanslar için kalıp materyalin ve baz/maliyet oranının stabilitesi iyileştirilmelidir. 

• Yanlış primer bağlanması fragmentasyona ya da enzimatik parçalanmaya yol açarak reaksiyon karışımındaki kalıp DNA’nın harcanmasına ve böylelikle sinyal kaybına yol açabilir.

Biyoinformatik ve moleküler genetik alanındaki ilerlemelere paralel olarak geliştirilen mikroarray teknolojisi tek bir çip üzerinde tüm genomun (DNA) ve ekspresyon ürünlerinin (RNA ve protein) incelenmesi yöntemidir. 2000’li yılların başında, mikroarray teknolojisinin gelişimi, aynı anda binlerce genin ekspresyonunun tayinine imkân vermiştir. Mikroarray teknolojisi, prob DNA’nın (binlerce genin her biri için bir tane) küçük miktarlarını içeren birçok sıralı, kuyucuklu, cam slaytlar olan DNA mikroçipleri ve sonuçları analiz eden bilgisayar programlarını da içeren bir teknolojidir.

Yöntemin uygulanmasında ilk olarak özgün ve farklı DNA hibridizasyon hedeflerini içeren yüksek yoğunluktaki noktalama işlemi bir mikrodizilim hâlinde cam bir destek üzerine yapılır. Ardından her deney için floresan işaretli cDNA işaretleyicileri hazırlanır: Bu işlem iki ayrı hedef hücre toplumunun mRNA’sının eldesi ile başlar. Farklı floresan boyalar kullanarak her mRNA örneğinin ayrı ayrı ters yazılımları gerçekleştirilir. İki farklı işaretleyici birleştirilerek ayrı ayrı cDNA hedefleri ile hibridize edilir. Sonra bir lazer tarayıcısı kullanılarak ortaya çıkan floresan ışımalar tespit edilir. Eğer iki örnekten birinde herhangi bir genin mRNA düzeyi yüksekse daha fazla cDNA söz konusu genle etkileşime girer ve o örneğin işaretlenmesinde kullanılan floresan boya daha fazla ışıma verir. Belirli bir noktada iki işaretli örneğin floresan yoğunluklarının oranı tarayıcı ile belirlenir. Ortaya çıkan sonuç bir veri tabanına aktarılarak incelenir.

Bu teknoloji gen ekspresyon farklılıklarına dayanarak tümör oluşumu, sınıflandırılması ve prognostik faktörlerin belirlenmesi konusunda yaygın kullanım alanı bulmuştur. Ayrıca birçok farklı hastalığın etiyolojilerinin ve moleküler düzenlerinin aydınlatılmasında, gelişim ve davranış biyolojisi alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Yine mikroarray teknolojisi ile SNP’lerin genotipleme çalışmaları yapılabilmektedir. Mikroarray teknolojisi ile farklı hücre tiplerinde (normal hücreler ile kanser hücreleri ya da böbrek hücreleri ile karaciğer hücreleri gibi) çok sayıda genin ekspresyon profilleri ölçülebilmektedir. Ayrıca bu yöntemle gen ekspresyonundaki aşırı değişimler veya farklı çevresel koşullara maruz kalan bir hücredeki değişiklikler de incelenebilir. Mikroarray teknolojisi gen ekspresyonunun belirlenmesi, mutasyon taramaları, genotipleme ve haritalama gibi uygulamalarda yaygın kullanım alanı bulmuştur. 

Populasyonda %1 veya daha fazla sıklıkta görülen DNA dizi değişiklikleri polimorfizm olarak %1’den daha az görülenler ise mutasyon olarak tanımlanır. Polimorfizm hastalık nedeni değil ancak hastalığa yatkınlık nedeni olabilirken mutasyon ise genellikle hastalık nedenidir. Genom dizisinde tek bir nükleotid değiştiğinde DNA baz dizisinde oluşan varyasyonlara Tek Nükleotid Polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) denir.