TIBBİ CİHAZ VE MALZEMELER Dersi İleri Moleküler Tanı, Tektik Cihaz ve Malzemeleri soru detayı:

CEVAP:

Reaksiyondaki her döngü üç evreden oluşmaktadır. Bu evreler; denatürasyon, primer bağlanması (annealing) ve primerlerin uzaması (extension) evreleridir (Resim 3.3). Bir döngü 3-5 dakika sürer ve 20-30 kez tekrarlanır. Bir döngü sonunda sentezlenen ürün öncekinin iki katı kadardır (Resim 3.4). Döngü sayısı n olarak kabul edilirse 2n çoğaltılmış DNA miktarını verir. Yaklaşık 2- 3 saat süren 20 döngü sonunda, 1.048.576, 30 döngü (228) sonunda ise 270.000.000 amplifikasyon ürünü elde edilir.

Denatürasyon Evresi: Çoğaltılması istenen DNA molekülü, 95oC’de 30 sn. ya da 97oC’de 15 sn. tutularak denatüre edilip tek dal hâline getirilir.

Primer Bağlanması (Annealing) Evresi: Primer adı verilen ve hedef DNA bölgesi için spesifik olan 18-24 baz uzunluğundaki oligonükleotid, denatürasyon sonucu oluşan DNA tek dalındaki kendine komplementer olan nükleotid dizisine bağlanır. Primerlerin bağlanması için ortam ısısı 40-60oC’ye düşürülür.

Primerlerin Uzatılması (Extension) Evresi: Bağlanma tamamlandıktan sonra primer hibritleştiği tek dalın karşılığını sentezler. Bu sentez için termostabil özelliği olan ve Thermus aquaticus adlı bakteriden elde edilen Taq polimeraz enzimi kullanılır. Bu enzim PCR’la DNA sentezi için gerekli olan yüksek optimum ısıya (Topt) sahiptir. Taq polimeraz 72oC sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılmaktadır.