VİROLOJİ Dersi VİRUSLARIN ÜRETİLMESİ soru cevapları:
Toplam 65 Soru & Cevap#1
SORU: Bir virüsün enfeksiyözite gücünün tespit edilmesine ne ad verilir?
CEVAP:
Bir virüsün enfeksiyözite gücünün rakamsal olarak ifadesi o virüsün titresidir. Bu gücün belirlenmesi işlemine de virüs titrasyonu adı verilir. Virüsün titresi süspansiyonunda bulunan enfektif partikül sayısıyla ilgili bilgi verir. Titrasyon amacıyla sulandırmalar hazırlanır ve her sulandırma basamağında belli sayıda konakçı (hücre kültürü, EYT, denek hayvanı) sisteme ekilir. Test sonucunda konakçı sistemlerin en az yarısının enfekte olmuş olması beklenir. Titrasyon işleminde genellikle hücre kültürleri kullanılmaktadır ve elde edilen titre birimi Doku Kültürü İnfektif Doz (DKID50) olarak ifade edilir.
#2
SORU: I. Konvansiyonel Hayvanlar
II. SPF (Spesifik Patojen Free) Hayvanlar
III. Germ Free Hayvanlar
Mikrobiyolojik özelliklerine göre deney hayvanları sınıflamasınsa hangileri yer alır?
CEVAP:
Mikrobiyolojik özelliklerine göre deney hayvanları 3’e ayrılmaktadır. Bunlar: ? Konvansiyonel Hayvanlar ? SPF (Spesifik Patojen Free) Hayvanlar ? Germ Free Hayvanlar
#3
SORU: Direkt olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro flartlarda
üretilmesi ile elde edilen kültürlere ne ad verilir?
CEVAP:
Direkt olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro flartlarda
üretilmesi ile elde edilen kültürlere primer hücre kültürü adı verilir.
#4
SORU: Hücre kültürlerinin yeni flakslara (plastik türevi maddelerden üretilmiş kültür şişeleri) alınarak çoğaltılması ile elde edilen kültüre ne ad verilir?
CEVAP:
Hücre kültürlerinin yeni flakslara (plastik türevi maddelerden üretilmiş kültür şişeleri) alınarak çoğaltılmasına subkültür hazırlama (veya pasaj) elde edilen kültüre de subkültür denir.
#5
SORU: Primer kültürlerin pasajlanmas›yla elde edilen ve genetik özellikleri bakımından köken aldığı dokuya en az %85 oranında benzerlik gösteren kültürlere ne ad verilir?
CEVAP:
Primer kültürlerin pasajlanmas›yla elde edilen ve genetik özellikleri bakımından köken aldığı dokuya en az %85 oranında benzerlik gösteren kültürlere diploid hücre kültürü denir.
#6
SORU: Direk olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro şartlarda üretilmesi ile elde edilen kültürlere ne ad verilir?
CEVAP:
Direk olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro şartlarda üretilmesi ile elde edilen kültürlere primer hücre kültürü denir.
#7
SORU: Virüs Titrasyonunun başlıca kullanım amaçlarından değildir?
CEVAP:
Titrasyonun başlıca amaçları: Virolojik ve serolojik çalışmalarda soyların standardizasyonu ? Aşı hazırlanmasında virus dozunun ayarlanması ? Virüslerin belirlenmesinde kullanılan fizikokimyasal testlerin değerlendirilemsi ? Virüs soylarının saflaştırılması (Plak Test)
#8
SORU: Kotun eritrositlerine karşı tavşanlarda elde edilen antikorlara ne ad verilir?
CEVAP:
Kotun eritrositlerine karşı tavşanlarda elde edilen antikorlar amboseptör olarak adlandırılır.
#9
SORU: Bir hastalık etkenine karşı antikor taşıdığı bilinen seruma ne ad verilir?
CEVAP:
Bir hastalık etkenine karşı antikor taşıdığı bilinen serum Pozitif Serum'dur.
#10
SORU: I. Hücreler pelet halinde elde edilir.
II. Bir miktar vasat ile sulandırılarak sayım yapılır ve en az 1×106 hücre/ml olacak şekilde sulandırılır.
III. Son sulandırmaya %10 dana serumu ve %10 DMSO eklenir.
IV. Saklama tüplerine 1-2 ml hacimde paylaştırılıp derin dondurucuya kaldırılır.
Hangileri hücrelerin dondurulması süreci işlem basamaklarındandır?
CEVAP:
? Subkültür hazırlama prosedüründe açıklanan basamaklar takip edilerek hücreler pelet halinde elde edilir. ? Bir miktar vasat ile sulandırılarak sayım yapılır ve en az 1×106 hücre/ml olacak şekilde sulandırılır. ? Son sulandırmaya %10 dana serumu ve %10 DMSO eklenir. ? Saklama tüplerine 1-2 ml hacimde paylaştırılıp derin dondurucuya kaldırılır.
#11
SORU: Embriyolu Tavuk Yumurtasına Virüs Ekimi nasıl yapılır?
CEVAP: Embriyolu yumurtalar ışık kaynağı altında incelenerek hava kesesinin sınırları ve embriyonun bulunduğu bölge kurşun kalemle işaretlenir. ? Ekim yapılacak bölge sırasıyla tentürdiyot ve alkolle dezenfekte edilir. ? Özel delici kullanılarak ekim noktasına iğnenin girebileceği büyüklükte bir ? delik açılır. ? Uzun uçlu bir iğne ile girilerek embriyonun olmadığı yöne doğru 45° açı ile ? ilerlenir. ? 0,2 ml virus ekilerek enjektör dikkatlice geri çekilir. ? Kabukta açılmış olan delik parafinle kapatılır ve yumurtalar dik pozisyonda, 35-37 °C’ye ayarlı %40-70 nemli inkübatörlere kaldırılır.
#12
SORU: Hücre kültürleri üretildikleri ortamlara göre kaça ayrılmaktadırlar?
CEVAP: Hücre kültürleri üretildikleri ortamlara göre ikiye ayrılır.
#13
SORU: Deney hayvanlarına uygulanabilecek değişik ekim yolları nelerdir ve nu ekim yolları deney hayvanlarının hangi özelliklerine göre belirlenir?
CEVAP: Deney hayvanlarına virüs inokulasyonunda yapılan çalışmanın amacına ve kullanılan virüs türüne göre seçilebilecek değişik ekim yollar vardır. Bunlardan en çok başvurulanlar arasında ? intranasal (burun boşluğuna), ? intratrakeal (trake içine), ? korneal, ? konjuktival, ? oral (ağız yoluyla), ? subkutan (deri alt›na), ? intradermal (deri içi), ? intravenöz (damar içi), ? intraperitoneal (periton içi) ve ? intramuskuler(kas içi) yolla yapılan inokulasyonlar sayılabilir.
#14
SORU: Hiper immunserum kavramını nasıl ifade edilebilir?
CEVAP: Bir antijenin duyarlı bir konakçıya belli bir program kapsamında verilmesiyle elde edilen ve bu etkene karşı yüksek miktarda antikor taşıyan serumdur.
#15
SORU: Embriyolu Tavuk Yumurtasına Virüs Ekimi süreci nasıldır?
CEVAP: Virüs ekimi yumurtanın farklı bölgelerinden yapılabilmektedir. Tüm noktalarda temel prensip aynı olmakla birlikte ekilen virüsün türüne bağlı olarak farklı uygulamalar da yapılabilmektedir. Newcastle hastalığı virüsünün üretilmesinde için 9-11 günlük yumurtalar kullanılarak koryo-allantoik boşluğa hava kesesi tarafından virüs ekiminin tüm aşamaları sayfa 40’da görülmektedir.
#16
SORU: Mikrobiyolojik özelliklerine göre yapılan deney hayvanları sınıflaması içerisinde SPF (Spesifik Patojen Free) Hayvanların kullanım özellikleri nasıldır?
CEVAP: Bünyelerinde hastalık etkeni (patojen) maddeler taşımazlar. Sürekli kontrol ve bakım altında tutulurlar. Su ve yemleri kontrolden geçirilir, yaşam ortamlarına filtre edilmiş hava verilir. Yapılan bilimsel çalışmalar konvansiyonel hayvanlar kullanılan çalışmalara göre daha güvenilir sonuçlar verir.
#17
SORU: Hücre Kültürü kavramı nasıl tanımlanabilir?
CEVAP: Hücre kültürü organizmadan alınan dokulardaki hücrelerin bireysel olarak ayrılması ve in vitro şartlarda kültüre edilmeleriyle elde edilir. Ayrıştırma mekanik veya enzimatik yolla gerçekleştirilir. Bu amaçla tripsin veya kollegenaz gibi proteolitik enzimler kullanılır. Vücuttaki birçok dokudan hücre kültürü hazırlanabilmesine rağmen, özellikle üreme yeteneği yüksek olan testis, böbrek, deri, diş eti ve kanserli dokulardan hücre kültürü hazırlamak ve bu kültürler ile çalışmak laboratuvar uygulamalarında kolaylık sağlamaktadır.
#18
SORU: Komponent kavramını nasıl ifade edilebilir?
CEVAP: Serumda bulunan ve antikorlar aracılığıyla gerçekleşen immunolojik reaksiyonlarda görev alan bir grup proteindir.
#19
SORU: Tripsin nedir?
CEVAP: Pankreastan salgılanan ve bağırsaklarda protein sindirimine aracılık eden bir enzimdir. Hücre kültürlerinde kullanılan tripsin enzimi domuz pankreasından elde edilmiştir. Genellikle toz halinde temin edilen bu madde fosfat tampon çözeltisi içerisinde hazırlanarak 0,2µm por büyüklüğüne sahip filtreden geçirilerek steril edilir ve hücre kültürlerinde kullanılır.
#20
SORU: Mikrobiyolojik özelliklerine göre yapılan deney hayvanları sınıflaması içerisinde Konvansiyonel Hayvanların kullanım özellikleri nasıldır?
CEVAP: Herhangi bir mikrobiyolojik müdahale yapılmayan, standart yetiştirme koşulları uygulanan hayvanlardır. Bünyelerinde hastalık olabilir veya olmayabilir. Bu yüzden kullanımlarında bazı kısıtlılıklar vardır. Ancak belirli biyolojik ürünlerin (komplement, amboseptör, negatif veya pozitif serum) elde edilmesinde rahatlıkla kullanılabilirler.Amboseptör kotun eritrositlerine karşı tavşanlarda elde edilen antikorlardır. Amboseptör komplement fikzasyon testinde kullanır. Negatif serum bir hastalık etkenine karşı antikor taşımadığı bilinen serumdur iken Pozitif serum da bir hastalık etkenine karşı antikor taşıdığı bilinen serumdur.
#21
SORU: Bir hastalık etkenine karşı antikor taşımadığı bilinen serum, aşağıdaki terimlerden hangisi ile ifade edilir?
CEVAP:
Negatif serum, bir hastalık etkenine karşı antikor taşımadığı bilinen serumdur.
#22
SORU: Deney hayvanlarının kullanılması sürecinde dikkat edilmesi gereken hususlar nelerdir?
CEVAP: Deney hayvanları bakım ve besleme giderleri nedeniyle hücre kültürleri ve embriyolu yumurtalara göre daha maliyetlidir. Kullanımları ile ilgili oarak da birçok etik sınırlama mevcuttur. Ancak hiperimmun serum ve komplement gibi biyolojik materyallerin elde edilmesi amacıyla zorunlu olarak kullanılırlar. Fare, rat, tavşan, maymun gibi hayvalar sıklıkla kullanılırken bilimsel araştırma amacıyla kedi, köpek, koyun, sığır gibi hayvanların da denek olarak kullanıldığı görülmektedir. Hiper immunserum bir antijenin duyarlı bir konakçıya belli bir program kapsamında verilmesiyle elde edilen ve bu etkene karşı yüksek miktarda antikor taşıyan serumdur. Komplement ise serumda bulunan ve antikorlar aracılığıyla gerçekleşen immunolojik reaksiyonlarda görev alan bir grup proteindir.
#23
SORU: Hücrelerin Çözülmesi süreci işlem basamakları nasıldır?
CEVAP: ? Derin dondurucudan çıkarılan hücreler 37 °C’ ye ayarlanmış su banyosunda hızla çözdürülür. ? 5-10 ml vasat içerisinde pipete edilen hücreler 1200 devir/dk h›zda 10 dk süreyle santrifüj edilir. ? Süpernatant atılır. Hücre peleti vasatla sulandırılıp süspanse hale getirilir ve daha önce hazırlanmış hücre kültür şişelerine geçilir. ? Hücre kültürünün üretilmesi ve takibi 37 °C’ye ayarlanmış inkübatörlerde yapılır.
#24
SORU: Mikrobiyolojik özelliklerine göre deney hayvanları kaça ayrılmaktadır?
CEVAP: Mikrobiyolojik özelliklerine göre deney hayvanları 3’e ayrılmaktadır.
#25
SORU: Mikrobiyolojik özelliklerine göre yapılan deney hayvanları sınıflaması içerisinde Germ Free Hayvanların kullanım özellikleri nasıldır?
CEVAP: Bünyelerinde hiçbir mikroorganizma bulundurmayan çok özel hayvanlardır. Özel şartlar altında annelerinden sezeryanla alınır. Su ve yemleri kontrol edilir, yaşam ortamlarına filtre edilmiş hava verilir. Dışkı ve kan örnekleri düzenli aralıklarla kontrol edilir. Yetiştirilmesi ve bakımı oldukça zor ve zahmetlidir. Bu hayvanlardan elde edilen veriler çok değerli ve güvenilirdir.
#26
SORU: Deney hayvanlarına en çok hangi ekim yöntemi uygulanmaktadır?
CEVAP: Değişik hayvanların yumurtalı kullanılabilse de virüs üretilmesi amacıyla en çok kullanılan embriyolu tavuk yumurtası (ETY)’dir. Özellikle kanatlı virüsü, bazı memeli virüslerinin üretimi ve aşı üretiminde yoğun bir şekilde kullanılır. ETY’lere ekim için sıklıkla kullanılan 4 bölgeyi ve ETY’lerin genel yapısını öğrenmek için sayfa 39 Şekil 3.1 ve Resim 3.2’yi inceleyiniz. ETY’de en yaygın olarak üretilen virüsler çiçek virüsleri, influenza virüsleri ve kanatlı virüsleridir.
#27
SORU: Devamlı hücre kültürü kavramının belirleyici özelliği nedir?
CEVAP: 70 pasajdan sonra elde edilen ve genetik olarak köken aldığı dokudan tamamen farklılaşmış kültürlere ise devamlı hücre kültürü denmektedir.
#28
SORU: Süpernatant nedir?
CEVAP: Süspansiyon halindeki bir sıvı santrifüj edildiğinde içerdiği katı faz (partiküller) çöker. Üstte kalan sıvı kısma süpernatant adı verilir
#29
SORU: Flask nedir ve flaksların belirleyici özellikleri nelerdir?
CEVAP: Hücreleri laboratuvar ortamında üretebilmek için kullanılan plastik türevi maddelerden imal edilmiş kültür şişelerine flask denilir. Sabit kültürlerde kullanılacak flasklar genellikle 25, 75 ve 150 cm2 taban alanına sahip olacak şekilde üretilir. Ayrıca roller kültürler için hazırlanan yuvarlak flasklarda vardır.
#30
SORU: İzotonik çözeltilerin belirleyici özellikleri ve muhtevası nedir?
CEVAP: Hücrelerin in vitro şartlarda üretilebilmesi için “hücre üretme vasatı” adı verilen sıvı ortamlar kullanılır. Hücre üretme vasatı, hücre çoğalması için gerekli olan amino asitler, vitaminler, mineraller, iz elementler, glukoz vb maddeleri içeren, steril ve pH’ı dengelenmiş bir izotonik çözeltidir. Hücre üretme vasatlarına gelişmeyi teşvik edici faktör olarak %10 oranında serum ilave edilir. Ayrıca bakteri kontaminasyonuna karşı çeşitli antibakteriyellerde ilave edilir
#31
SORU: Embriyolu Tavuk Yumurtasına Virüs Ekimi sonrasındaki süreç nasıldır?
CEVAP: Ekim sonrasında ilk 48 saat içinde meydana gelen ölümler teknik hataya bağlıdır. Bir süre sonra embriyo ölmemişse buzdolabına (+4 °C) kaldırılarak 2-4 saat bekletilir. Bu süreçte embriyo ölür. Virus üremesinin tespit edilebilmesi için korioallantoik boşluktan bir miktar sıvı alınarak hemaglütinasyon testi uygulanır.
#32
SORU: Embriyolu Tavuk Yumurtasına Virüs Ekimi sonrasında virüsün üreyip üremediği nasıl anlaşılır?
CEVAP: Uygulanan testten pozitif sonuç alınması virusun ürediğine işaret eder.
#33
SORU: Organ kültürü kavramı nasıl tanımlanabilir?
CEVAP: Organ veya doku parçalarının canlılıklarını sürdürmek üzere vücut dışında belli bir süre muhafaza edilmeleri veya üretilmeleri organ kültürü olarak tanımlanır. Bu kültürler üç boyutlu yapılarını ve organizma içindeki şartlarda sahip oldukları histolojik özelliklerin birçoğunu muhafaza ederler.
#34
SORU: Süspanse Kültürler hazırlanması ve çoğalması hakkında bilgi veriniz?
CEVAP: Bu tip kültürlerde hücreler kültür kabına tutunmadan hücre üretme vasatı içerisinde süspanse haldeyken çoğalmaktadır.
#35
SORU: Subkültür Hazırlanması süreci hakkında bilgi veriniz?
CEVAP: Monolayer hücre kültürleri kabın zeminini kapladıklarında pasajlanmaları gerekir. Bu hem yaşlanan hücrelerin dejenerasyonunu ve ölümünü engelleyerek hücre kültürünün devamını sağlar hem de daha fazla miktarda hücre ile çalışma imkânı verir. Hücrelerin kap yüzeyinden ayrılması için tripsin enzimi kullanılır. Pronaz, dispaz ve kollegenaz enzimleri de kullanılabilir ve kullanılacak enzim hücre tipine göre seçilir.
#36
SORU: Dejenerasyon nedir?
CEVAP: Hücrenin normal morfolojik ve fizyolojik bütünlüğünü kaybetmesidir.
#37
SORU: Stationer Kültürler ve Monolayer hücre kültürü hakkında bilgi veriniz?
CEVAP: Bu tip hücre kültürlerinde hücreler kültür kabı yüzeyine tutunarak çoğalırlar. İnkübatör raflarında (sabit kültür) veya özel bir düzenekle dönen bir sistem içerisinde (roller kültür = dönen kültür) inkübe edilebilirler. Roller kültürler şişelerde veya tüplerde hazırlanabilir. Stationer kültürlerde hücreler çoğunlukla kültür kabı yüzeyini tek tabaka halinde kaplamaktadır. Buna monolayer hücre kültürü denir. Hücrelerin monolayer tabakalanması özellikle virüslerin üretilmesi sarasında oluşacak sitopatolojik değişiklikleri (CPE) takip edebilmek açısından önemlidir.
#38
SORU: Hücrelerin Dondurulması ve Çözülmesi süreci hakkında bilgi veriniz?
CEVAP: Hem primer hem de devamlı hücrelerin bir kısmı dondurularak saklanır ve ihtiyaç halinde çözülüp yeniden kullanılabilir. Hücrelerin canlılıklarını koruyabilmesi için gereken sıcaklık en az -70 C0 gereklidir ve hücreler böylelikle 1 yıldan daha fazla canlılıklarını koruyabilmektedirler. Daha uzun süreler için sıvı azot (-196 °C) gereklidir. Hücrelere zarar vermemek için dimetil sülfoksit (DMSO) veya gliserin gibi koruyucu maddeler kullanılır. Hücrelerin dondurulması ve çözülmesi için uygulanması gereken basamaklar sayfa 43-44’de belirtilmiştir.
#39
SORU: Subkültür Hazırlanması süreci basamakları nasıldır?
CEVAP: ? Hücre kültür şişesindeki vasat hücrelerin bulunmadığı yüzeyden dökülerek uzaklaştırılır. ? Hücre yüzeyleri PBS ile yıkanır ve PBS uzaklaştırılır. ? Kültür şişesine, hücrelerin yüzeyini örtecek şekilde tripsin çözeltisi ilave edilir. ? İnkübatörde (37 °C) 5-10 dk süreyle bekletilerek hücrelerin yüzeyden ayrılmaları sağlanır. ? Tripsin çözeltisi içinde serbest hale geçen hücreler santrifüj tüpüne aktarılarak 1000 devir/dakika hızda 10 dk santrifüj edilir ? Üstte kalan süpernatant atılır. ? Hücre peleti belli bir miktar hücre üretme vasatı ile süspanse edilerek Thoma lamında hücre sayımı yapılır ve hücre yoğunluğu mililitrede 50.000100.000 hücre olacak şekilde hazırlanır. Bu sulandırma işleminde kullanılan hücre üretme vasatının %10’u oranında dana serumu ilave edilmelidir. ? Elde edilen hücre süspansiyonu yeni kültür şişelerine aktarılarak 37 °C’ye ayarlanmış inkübatörlerde kültüre edilir.
#40
SORU: Virüsler, hücre kültüründe üremeleri sonucunda meydana getirdikleri değişikliklere göre kaç gruba ayrılırlar?
CEVAP: Virüs üremesine bağlı olarak duyarlı hücre kültürlerinde meydana gelen morfolojik değişimler sitopatolojik etki (CPE) olarak adlandırılır. Yeni nesil olgun virüs partikülü oluşumu ile sonuçlanan (prodüktif = üretken) enfeksiyonların tamamı hücre kültüründe CPE oluşumuna neden olmayabilir. Virüsler, hücre kültüründe üremeleri sonucunda meydana getirdikleri değişikliklere göre Sitopatojen virüsler, Proliferatif virüsler ve Sitopatojen olmayan virüsler olmak üzere üç grupta toplanır.
#41
SORU: Hücre Kültürlerine Virüs Ekimi süreci hakkında bilgi veriniz.
CEVAP: Virüs ekimi için hücre kültürlerinin yeni hazırlanmış olması (1-2 günlük) ve kültür kabı zeminini en az %80 oranında kaplamış olması tercih edilir. Laboratuvar çalışmalarında Adsorbsiyonlu yöntem ve Adsorbsiyonsuz yöntem olmak üzere sıklıkla kullanılan 2 tip virüs ekim yöntemi vardır. Burada inokolum kavramının bilinmesi gerekmektedir. İnokulum; teşhis materyallerinin değişik yöntemlerle işlenmesiyle elde edilen ve hücre kültürüne ekim için hazırlanmış materyallerdir.
#42
SORU: Sitopatojen Virüslerin Üremesine Bağlı Hücresel Değişiklikler nasıl oluşmaktadır?
CEVAP: Hücrelerde oluşan değişikliklerin başlıca nedenleri viral proteinlerin hücresel protein sentezini sekteye uğratması, virüs çoğalmasına bağlı toksik etki ve hücre zarına yerleşen viral proteinlerin membran yapısını bozarak ozmotik basıncı olumsuz yönde etkilemesi olarak sıralanabilir.
#43
SORU: Plak Test nasıl ve niçin yapılmaktadır?
CEVAP: Birçok virüs türü hücre kültürlerinde çoğalma sırasında enfekte veya dejenere hücrelerden oluşan üreme odakları şekillendirir. Sınırları belirli olan ve çoğunlukla hücre erimesi, dejenerasyonu veya proliferasyonu ile karakterize olan bu üreme alanları plak olarak tanımlanır. Monolayer hücre kültürlerinde her plak bir enfektif virüs partikülü tarafından oluşturulur. Vasat içerisinde yarı katı bir ortam kullanılarak enfektif partiküllerin sayısını belirlemek mümkündür. Yapılan çeşitli işlem ve sulandırmalardan sonra virüs çoğalma odakları (plak) şekillenir. Testin değerlendirilebilmesi için sağlıklı hücreler kırmızı renge boyanır ve boyanmamış alanlar plak oluşturma ünitesi (POÜ) değerini belirler. Pratik olarak her bir alanın bir virüsü temsil ettiği varsayılır ve toplam virüs partikülü sayısı belirlenmiş olur. Tüm virüsler plak oluşturmazlar. Dolayısıyla sadece plak oluşturan virüsler için uygun bir testtir. Ayrıca karışık olan virüs izolatlarının veya aynı virüse ait değişik biyotiplerin saflaştırılması amacıyla da kullanılır.
#44
SORU: Proliferatif Virüslerin Üremesine Bağlı Değişiklikler nasıl oluşmaktadır?
CEVAP: Monolayer hücrelerin virüs üremesine bağlı olarak tabakalanıp yığın halinde çoğalması proliferative etki olarak adlandırılır. Hücre kültüründeki proliferasyon çoğunlukla lokaldir. Zaman zaman hücre kültürünün tamamına yayılmış bir proliferasyon da gözlenebilir. Proliferasyon daha çok tümör oluşturan virüslerin üremesine bağlı olarak şekillenir.
#45
SORU: Sitopatojen Olmayan (Hücre Kültüründe Morfolojik Değişim Yapmadan Çoğalan) Virüsler nasıl üretilmektedir?
CEVAP: Bazı virüs türlerinde hücre kültüründe üremesi sırasında morfolojik değişimler gözlenmez. Bu tür virüslerin üreme ve üreme miktarlarının belirlenebilmesi için bazı özel testlere ihtiyaç vardır. Bu amaçla en sık kullanılan teknikler Hemadsorbsiyon testi, immunoperoksidaz testi, immnunofloresan testi, interferens ve Elektron mikroskobik incelemelerdir. Hücre üremesinin tespit edilmesi konusuna bağlı olarak Sinsityum, İnklüzyon cisimciği, Hiperkromazi, Hemadsorbsiyon kavramları sayfa 45 de açıklanmıştır.
#46
SORU:
Virus üretilmesinde kullanılan ortamlar nelerdir?
CEVAP: - Deney hayvanları
- Konvansiyonel hayvanlar
- Spesifik patojen free hayvanlar
- Germ free hayvanlar
- Embriyolu yumurtalar
- Hücre kültürleri
- Konvansiyonel hayvanlar
- Spesifik patojen free hayvanlar
- Germ free hayvanlar
#47
SORU:
Virusların üretilmesi amacıyla sıklıkla kullanılan deney hayvanlarına örnek veriniz.
CEVAP:
Tavşan, rat, fare, hamster, civciv ve maymunlar
#48
SORU:
Deney hayvanlarına virus inokulasyonunda kullanılan ekim yollarına örnek veriniz.
CEVAP:
İntranasal (burun boşluğuna), intratrakeal (trake içine), korneal, konjuktival, oral (ağız yoluyla), subkutan (deri altına), intradermal (deri içi), intravenöz (damar içi), intraperitoneal (periton içi) ve intramuskuler (kas içi)
#49
SORU:
Virus üretilmesi için en yaygın kullanılan embriyolu yumurta nedir?
CEVAP:
Embriyolu tavuk yumurtası
#50
SORU:
Embriyolu tavuk yumurtasında en yaygın olarak üretilen viruslar nelerdir?
CEVAP:
Çiçek virusları, influenza virusları ve kanatlı virusları
#51
SORU:
Embriyolu tavuk yumurtasına koryo-allantoik boşluğa hava kesesi tarafından virus ekimi nasıl yapılır?
CEVAP: - Embriyolu yumurtalar ışık kaynağı altında incelenerek hava kesesinin sınırları ve embriyonun bulunduğu bölge kurşun kalemle işaretlenir.
- Ekim yapılacak bölge sırasıyla tentürdiyot ve alkolle dezenfekte edilir.
- Özel delici kullanılarak ekim noktasına iğnenin girebileceği büyüklükte bir delik açılır.
- Uzun uçlu bir iğne ile girilerek embriyonun olmadığı yöne doğru 45° açı ile ilerlenir.
- 0,2 ml virus ekilerek enjektör dikkatlice geri çekilir.
- Kabukta açılmış olan delik parafinle kapatılır ve yumurtalar dik pozisyonda, 35-37 °C’ye ayarlı % 40-70 nemli inkübatörlere kaldırılır.
#52
SORU:
Hücre kültüründe primer kültür ve subkültür terimini açıklayınız.
CEVAP:
Direkt olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro şartlarda üretilmesi ile elde edilen kültürler primer hücre kültürü olarak adlandırılır. Bu kültürler virus izolasyon çalışmalarında yüksek duyarlılık sağlar. Hücre kültürü şişelerinde (flask) üretilen hücrelerin üretildiği ortamdan kaldırılarak yeni kültür şişelerine aktarılması ve böylece miktar olarak çoğaltılması subkültür hazırlama (veya pasaj), elde edilen yeni kültürler ise subkültür olarak tanımlanır.
#53
SORU:
Primer kültürlerin pasajlanmasıyla elde edilen ve genetik özellikleri bakımından köken aldığı dokuya en az % 85 oranında benzerlik gösteren kültürlere ne ad verilir?
CEVAP:
Diploid hücre kültürü
#54
SORU:
Devamlı hücre kültürü nedir? Nasıl elde edilir?
CEVAP:
Sonsuz sayıda pasajı yapılabilen ve genetik olarak köken aldığı dokudan tamamen farklılaşmış olan hücre kültürlerine ise devamlı hücre kültürü denir. Devamlı hücre kültürleri primer kültürlerin yaklaşık 70 kez pasajlanmasından sonra elde edilebilir.
#55
SORU:
Hücre üreme vasatı hangi maddeleri içerir?
CEVAP:
Hücre üretme vasatı, hücre çoğalması için gerekli olan amino asitler, vitaminler, mineraller, iz elementler, glukoz vb. maddeleri içeren, steril ve pH’sı dengelenmiş bir izotonik çözeltidir. Hücre üretme vasatlarına gelişmeyi teşvik edici faktör olarak %10 oranında serum ilave edilir. Hücre üretme vasatlarına ayrıca bakteri kontaminasyonlarına karşı antibiyotikler (penisilin 100 UI/ml, streptomisin 100 µg/ml) ve mantar kontaminasyonlarına karşı antimikotikler (mikostatin, 2,5 µg/ml) de ilave edilir.
#56
SORU:
Hücreleri kültür kabı yüzeyinden ayırmak ve süspanse hale getirmek amacıyla genellikle hangi enzim kullanılır?
CEVAP:
Tripsin
#57
SORU:
Hücreleri dondurma işleminde zarar görmemeleri için kullanılan koruyucu maddelere örnek veriniz.
CEVAP:
Dimetilsülfoksit (DMSO), gliserin
#58
SORU:
En sık kullanılan hücre kültürlerine virus ekimi yöntemleri nelerdir?
CEVAP:
Adsorbsiyonlu yöntem ve Adsorbsiyonsuz yöntem
#59
SORU:
Adsorbsiyonlu yöntemle virus ekimi nasıl yapılır?
CEVAP: - Kültür şişesindeki hücre üretme vasatı hücrelerin bulunmadığı yüzeyden dökülerek uzaklaştırılır.
- Hücre yüzeyleri hücrelere zarar vermeyecek şekilde PBS ile yıkanır.
- Kültür şişesine hacminin % 1’i oranında viruslu materyal konulur.
- Kültürler 37°C’ye ayarlı inkübatöre kaldırılarak 1 saat inkübe edilir.
- Süre sonunda inokulum otoklav edilmek üzere boşaltılır.
- Hücre yüzeyleri PBS ile yıkanır.
- Kültür şişesine vasat ilave edilerek inkübatöre kaldırılır. Burada kullanılan vasat içerisinde serum bulunmaz veya virusa özgün antikor taşımadığı bilinen fötal dana serumundan çok az miktarda (% 1-2) ilave edilebilir.
#60
SORU:
Virusları hücre kültüründe üremeleri sonucunda meydana getirdikleri değişikliklere göre sınıflandırınız.
CEVAP: - Sitopatojen viruslar
- Proliferatif viruslar
- Sitopatojen olmayan viruslar
#61
SORU:
Sitopatojen olmayan virusların üremesinin tespit edilmesi için kullanılan teknikler nelerdir?
CEVAP: - Hemadsorbsiyon testi
- İmmunoperoksidaz testi
- İmmnunofloresan testi
- İnterferens ve Elektron mikroskobik incelemeler
#62
SORU:
Virus titrasyonu nedir?
CEVAP:
Bir virusun enfeksiyözite gücünün rakamsal olarak ifade edilmesi o virusun titresi olarak tanımlanır. Enfeksiyözite gücünün tespit edilmesi ise virus titrasyonu olarak adlandırılır. Bir virusun titresi o virus süspansiyonunda bulunan enfektif virus partiküllerinin sayısı ile ilgili bilgi verir.
#63
SORU:
Virus titrasyonunun başlıca kullanım amaçları nelerdir?
CEVAP: - Virolojik ve serolojik çalışmalarda kullanılacak virus soylarının standardizasyonu
- Aşı hazırlanmasında virus dozunun ayarlanması
- Virusların identifikasyonunda kullanılan fiziko-kimyasal testlerin değerlendirilmesi
- Virus soylarının saflaştırılması (plak test)
#64
SORU:
Plak testi nedir? Açıklayınız.
CEVAP:
Birçok virus türü hücre kültürlerinde çoğalma sırasında enfekte veya dejenere hücrelerden oluşan üreme odakları şekillendirir. Sınırları belirli olan ve çoğunlukla hücre erimesi, dejenerasyonu veya proliferasyonu ile karakterize olan bu üreme alanları plak olarak tanımlanır. Tek tabakalı (monolayer) hücre kültürlerinde her plak bir enfektif virus partikülü tarafından oluşturulur. Virusların vasat içerisinde serbest yayılımını engelleyen yarı katı bir ortam kullanılarak virus süspansiyonunda bulunan enfektif partiküllerin sayısını belirlemek mümkündür. Bu amaçla öncelikle petri kutularında tek tabakalı hücre kültürü hazırlanır. Virus süspansiyonunun 10 katlı sulandırmaları yapılır ve her sulandırma basamağından 4 adet petri kutusuna ekim yapılır. Hücrelerin üzeri sıvı vasat yerine agaroz veya noble agar içinde hazırlanan yarı katı bir hücre üretme vasatıyla kaplanır. Böylece virus çoğalmasıyla ortaya çıkan yeni nesil virus partiküllerinin kültür ortamında serbestçe yayılımı engellenerek sadece enfekte hücreye komşu olan hücreleri enfekte etmesine olanak tanınır. Bu şekilde virus çoğalma odakları (plak) şekillenir. Testin değerlendirilebilmesi için sağlıklı hücreler genellikle nötral red vb. vital bir boya ile boyanır ve boya almamış alanlar şeklinde ortaya çıkan plaklar sayılarak virusun plak oluşturma ünitesi (POÜ) değeri belirlenir. Pratik olarak her plak alanının tek bir virus partikülü tarafından oluşturulduğu kabul edilerek süspansiyondaki toplam virus partikülü sayısı belirlenmiş olur. Tüm viruslar plak oluşturma özelliğine sahip değildir. Dolayısıyla plak titrasyon testi sadece plak oluşturabilen virusların enfektif güçlerinin tespiti için kullanılır. Plak testin bir diğer kullanım alanı da karışık olan virus izolatlarının veya aynı virusa ait değişik biyotiplerin saflaştırılmasıdır.
#65
SORU:
Virusların çoğaldığı hücrelerde meydana gelen değişikliklerin başlıca nedenlerini yazınız.
CEVAP:
Virusların çoğaldığı hücrelerde meydana gelen değişikliklerin başlıca nedenleri olarak viral proteinlerin hücresel protein sentezini sekteye uğratması, hücrede virus çoğalmasına bağlı olarak şekillenen toksik etki ve hücre zarında yerleşen viral proteinlerin membran geçirgenliğini bozarak ozmotik basıncı olumsuz yönde etkilemesi sayılabilir.