DNA Adenin ve Timin ile Guanin ve Sitozin purin ve pirimidin bazlarının özgün bir biçimde karşı karşıya gelerek hidrojen bağlarıyla birbirine bağlanmasıyla oluşur. Tüm bazlar bir deoksiriboz şeker molekülü ile bağlanmış durumdadır ve bu şeker moleküllerinde fosfat bağları vardır. Bu fosfat bağları birbirine alt alta gelen purin ve pirimidin çiftlerini birbirine bağlayarak çoğalmasını sağlar. Bu durum polimerizasyon diye adlandırılır.  tüm canlılarda olduğu gibi bakterilerde de kalıtsal tüm özellikleri belirler. DNA molekülü çift sarmal şeklinde bulunur. Her sarmal bir diğerine kıvrılarak sarılmış durumdadır. Bu her sarmalda normal olarak adeninin karşısında timin, guanin karşısında sitozin molekülü bulunmaktadır. Her sarmal diğerinin tamamlayıcısı, yani komplementeri durumundadır. 

RNA yapısı DNA’nınkinden daha farklıdır. Yapısında bulundurduğu şeker deoksiriboz yerine riboz’dur. RNA molekülünde DNA’daki timin yerine urasil yer alır. DNA’daki gibi RNA molekülünün komplementeri yani tamamlayıcısı bir karşı sarmal olmadığından normal olarak tek zincirlidir. RNA’nın bakteri içinde bulunan özel formları olan transfer RNA ve ribozomal RNA’larda bazı bölgelerinde çiftleşmiş (dubleks) baz çiftleri oluşur. 

DNA zincirlerinden her biri bir ana molekül olarak rol oynayarak karşısına uygun olan nükleotid bazlarının yerleşmesi ile kendi eş molekülünün sentezlenmesini sağlar. Kendi eşini sentezlenmesini sağlayan bir birinden ayrılmış her bir ana DNA molekülüne (zincirine) templeyt adı verilir. Yeni bir DNA molekülünün üretimi için yapılan kopyalama işine replikasyon denir. Ve her bakteri bölünmesinde bakteri DNA’sı bu işlemi gerçekleştirir. DNA kullanımıyla RNA sentezlenmesi işlemine ise transkripsiyon adı verilir. Yeni DNA işlemi için gerekli temel enzim DNA polimeraz enzimidir.

Bazen DNA polimerizasyonu veya sentezi sürecinde polimeraz enzimi bazı yanlış nükleotid dizilerinin oluşumunu engelleyemez. Bu durumda kendiliğinden (spontane) mutasyonlar oluşabilir. Bu mutasyonların oluşmaması için DNA bazen bu hataları düzeltme mekanizmaları geliştirmiştir. Bunlara hata düzeltme veya yanlış okumayı bulma sistemleri denir. Bu sayede bakterilerde değişik mutasyonlar önlenmiş olur. Ancak hata düzeltilirken süreç replikasyon işleminin uzamasına neden olur.

Temel olarak hücre bölünmesinden önce her bölünen hücreye bir kromozomun girmesi için ana hücrede en az iki kopya kromozoma gereksinim vardır. Bundan dolayı kromozom hücre bölünmesiyle ayarlı olarak replike olmalıdır. Bir bakteriyel kromozomun replikasyonu belli bir noktadan başlar. Bu noktaya “oriV” denir. Replikasyon her iki yönde bir noktaya dek sürer. Bu bitiş noktasına “ter” denir. Replikasyon RNA polimeraz enzimi denen bir enzimle üretilen ufak bir RNA parçasıyla her bir sarmalda başlatılır ve DNA polimeraz III adlı bir enzimle yürütülür. Hemen daha sonra görevi esas polimerizasyondan sorumlu enzim olan DNA polimeraz I devir alır ve bu ufak RNA parçası ayrılır. Bu işlemlerin olması için her bir DNA sarmalının daha önceden ayrılmış olması gerekir. Denaturasyon işlemini yapan enzim ise helikaz enzimidir. Ayrılan dizilerin ise tekrar bir araya gelmeksizin replikasyonun sonuna dek tek sarmal olarak kalması için ise tek zincirli DNA bağlayıcı protein (SSB) devreye girer. Genel olarak E.coli denen bakteride bu süreç 40 dk sürer. Daha sonra replikasyon başlangıcı ile hücre bölünmesi arasında da 20 dk geçer ve toplam süre 60 dk dır. Ancak daha uygun şartlar altında bu süre 20 dakikaya inebilir. DNA replikasyonunun başlangıcı hücre bölünmesi ile değil, hücre hacminin bir fonksiyonu olarak uyarılır. DNA replikasyonu sonlandığı zaman iki ayrı DNA molekülü bakteri hücresi kutuplarına doğru ilerler ve hücre bölünmesini başlatır. Replikasyonun başlangıcı için ise hücrenin belli bir kritik kitleye ulaşması gerekir. Daha sonra DnaA adlı protein molekülleri DNA’nın ori bölgesindeki DnaA kutuları denen bölgelerine yapışırlar. Böylece DNA zincirlerinin birbirinden ayrılmasıyla replikasyon başlar. Olgun DNA’da her pozisyondaki adenin artıklarına metil gruplarının eklenmesiyle DNA metile edilmiş durumdadır. Yeni sentezlemiş DNA’nın ise sadece bir sarmalı metillenmiş durumdadır; diğer sarmalda metilasyon yoktur. Bu durum DNA molekülünün tekrar replike olmasını önler. Bu molekül ancak her 2 sarmalı da metillenince replikasyona hazır hale gelir.

Replikasyon süreci içinde aynı zamanda DNA molekülünden trankripsiyon denen bir işlemle bir master RNA molekülü sentez edilir. Transkripsiyon işlemi RNA polimeraz enzimi tarafından gerçekleştirilir. RNA polimerizasyonu da denen transkripsiyon işlemi için DNA replikasyonundaki gibi bir başlatıcı nukleotid dizisine gereksinim yoktur. Bu nedenle transkripsiyondan çok daha basit bir süreçtir. Transkripsiyon sonu oluşan bir ulak RNA (mesenger RNA; mRNA) molekülüdür. Bu mRNA molekülünde köken aldığı DNA parçasındaki genlerin kodladığı proteinlerin hangi proteinler olduğu şifreli durumdadır. mRNA molekülü içinde proteinleri veya polipeptidleri oluşturan her bir amino asit için her üç bazdan oluşan bir genetik kod içeren bölgeler bulunur.

mRNA molekülü içinde proteinleri veya polipeptidleri oluşturan her bir amino asit için her üç bazdan oluşan bir genetik kod içeren bölgeler bulunur. Bu genetik koda triplet veya kodon denir. Her kodon belli tek bir amino asidi kodlar. Veya bu kodon protein sentezini durduran bir dur sinyali oluşturur. Bu şekilde 64 adet farklı kodon grubu mevcuttur. Bu nukleotid üçlüsü (triplet) veya kodon bilgisi evrenseldir. Her canlı türünde aynı bilgiyi içerir. Ancak bazen farklılıklara rastlanabilir. Örneğin UGA kodonu normalde bir dur kodonu olmasına rağmen bazen triptofan veya sistein amino asitlerini kodlayabilir. Bu evrensel kodlar türlerin evrimi sürecinde oluşan bir işlemdir ve o aşamada sabitlenmiştir.

Bakterilerde protein sentezi üniteleri olan ribozom elemanları çökme katsayılarına göre iki alt üniteden oluşur. Bunlar 50S ve 30S komponentleridir. Tüm ribozomal ünite 70S olarak tanımlanır. Büyük 50S kısmı 23S ve 5S’lik iki RNA molekülü ve buna ilaveten 31 farklı polipeptid içerir. Ufak parça işe 16S’lik bir RNA molekülü ve 21 polipeptid barındırır. Bakterilerde ribozomlar mRNA’nın spesifik kısımlarına (Ribozom-bağlanma bölgesi; RBS) bağlanır. Bu dizi 16S rRNA’nın 3’ ucu için kısmen komplementerdir. Bu nedenle ribozoma bağlanma hidrojen bağlarıyla komplementer baz dizileri arasında oluşur.

Translasyonun başlaması için 30S alt ünitesi RBS’ye bağlanır ve bir başlatıcı transfer RNA (tRNA) bitişiğindeki başlangıç kodonu ile ilişkiye girer. Bu başlangıç kodonu genellikle AUG, bazen GUG, nadiren de CUG olur. Daha sonra 50S alt ünitesi bu başlangıç kompleksine katılır ve translasyon işlemi başlatılır. Bu basamakların hepsinde çok sayıda başlatma faktörleri ismi verilen ribozomlara ait olmayan protein molekülleri görev yapar. Her ribozom mRNA boyunca hareket eder ve bir dur kodonuna ulaşınca fonksiyonunu tamamlar. Durma noktasında bu kodonu tanımlayacak bir tRNA olmadığı için translasyon durur. Böylece “polipeptid zinciri serbestleştirme faktörü” denen proteinlerce salınır ve ribozom mRNA’dan ayrılır. Translasyon işlemi sonunda oluşan amino asitler birbirlerine bağlanarak bakteriye özgün polipeptid moleküllerini şekillendirmiş olurlar. Bu polipetid zincirleri translasyon sonrası belli biyolojik işlemlerden geçirildikten sonra biyolojik olarak aktif proteinlere dönüştürülürler ve bakteriler tarafından intraselüler veya ekstraselüler yapısal komponentler olarak kullanılırlar.

Bakterilerin yapılarında veya özelliklerinde normalin dışında oluşan değişimlere yol açan DNA bozukluklarına mutasyon denir.

Nokta mutasyonlarında DNA dizisi tek bir pozisyonda değişmiş veya değiştirilmiş olur. Dizide bir nukleotid bir başkası ile yer değiştirdiğinde buna “tek baz yer değiştirmesi” adı verilir. Bu durumda gelişen ve gözlenen farklılaşma mutasyonun DNA’nın neresinde olduğuna bağlı olarak değişir. Bu değişim eğer DNA’nın protein kodlayan bir bölgesinde ise bu durumda oluşan proteinde farklılık oluşacak ve proteinin fonksiyonu bozulacaktır. Örneğin, UUA kodonu lösin amino asidini kodlar. Bu kodonda UUG ve CUA gibi iki alternatif mutasyon olduğu düşünüldüğünde, bu mutasyonlar durumunda oluşan kodonlar yine aynı amino asidi, yani lösini kodladığından mutasyonun hiçbir etkisi gözlenmez. Buna “sessiz mutasyon”, oluşan kodonlara da “sinonim kodonlar” adı verilir. nokta mutasyonunun biyolojik önemi amino asitler arası değişimdeki benzerliğe veya farklılığa bağlıdır. Bunlar dışında mutasyon sonucu eğer UAA veya UGA gibi kodonlar oluşursa, bunlar “dur” veya “sonlandırma” kodonları olduğu için, polipeptid üretimi durur. Bu durumda gereksinilen protein üretilmediği için oluşacak proteinin önemine bağlı olarak bakteride gözle görülür değişimler veya ölüm şekillenebilir. 

Bir başka nokta mutasyon tipi de tek bir dizi pozisyonundan bir nukleotidin yok olması veya girmesidir. Bu mutasyon tipine DNA dizisinin okunan bölgesinde (anlamlı bölgesi) olduğu için “anlamlı bölge mutasyonu” (frame shift mutasyon) adı verilir. Bu mutasyon durumunda da bakterinin fonksiyonlarında önemli değişimler gözlenir.

Bakterilerde antibiyotik veya bakteriyofaj dirençliliğini, gerekli metabolitlerin biyosentezini veya karbon kaynaklarının kullanımını etkilemeyen çok sayıda gen bulunur. Bu genlerden bazıları çok önemli genler olup, bu genlerdeki mutasyonlar ölümcül etkiler taşıyabilir veya bakterinin üremesini engelleyebilir. Belli koşullar altında normal işlevini yapan genlerin defekti ancak koşullar değiştirilince ortaya çıkar. Örneğin, bir bakterinin sıcaklığa duyarlı bir mutantı oluştuğunda, bu bakteri DNA’sı normal olarak 30.8 C’de replike olabilirken, 43 C gibi yüksek ısılarda replike olamaz, yani üreyemez.

Delesyonlarda bir gen veya birden fazla gen parçası tümüyle yok olmuş durumdadır. Bu durumda delesyona uğramış DNA bölgesinin veya genlerin fonksiyonları tamamen yok olur. Delesyon olguları DNA’da kolayca belirlenebildiği için DNA analizi ile tespiti son derece kolaydır. Delesyonlar asla geri dönüşümlü durumlar değildir; bir kez oluşunca mutasyonun düzelmesi söz konusu olamaz.

DNA’da oluşan bir diğer büyük ölçekli değişim veya varyasyon türü de dış kaynaklı bir DNA parçacığının bir gen içine girmesidir. Bu giriş işlemine “insersiyon” adı verilir. İnsersiyon oluştuğunda ilgili gen tümüyle inaktive olur ve fonksiyonları ortadan kalkar. Bu tip bozukluğa yol açabilen ve DNA’ya spesifik olarak insersiyon yapan ufak DNA elementleri bulunmaktadır. Bunlara insersiyon dizileri (insersiyon sekansları; IS) denir. Bu IS parçacıklarının DNA’ya girdiklerinde oluşturdukları mutasyon “insersiyon mutasyonu” olarak bilinir.

Transpozonlar DNA’nın bir bölgesinden bir başka bölgesine yer değiştirirler. Transpozonlar taşıdıkları bir veya daha çok tanımlanabilir genetik işaretle IS elementlerinden farklılık gösterirler. Genetik biliminde en çok çalışılan transpozonlar antibiyotik dirençlilik genlerini taşıyanlardır. Transpozonlar antibiyotik dirençliliğinin gelişimi ve yayılımı ile ilgili araştırmalarda en çok kullanılan genetik unsurlardır. Bir başka mutasyon yaratan kısa DNA parçacığı ise değiştirici (invertible) DNA sekanslarıdır. DNA’nın bir bölgesini ters tarafa döndürebilir. Bu dönen bölge eğer bitişik genin ekspresyonu için gerekli ise, değişim ilgili genin fonksiyonlarını uyarabilir veya tümüyle durdurabilir. Bu etkinin en iyi örneklenebileceği durum, Salmonella flagellar antijenlerindeki varyasyondur.

Rekombinasyon aslında temel genetikte ayrılan homolog DNA sarmallarının tekrar bir araya gelmesi anlamında kullanılmakla beraber, bir mutasyon tipini de ifade etmektedir. En basit anlamda, iki doğrusal DNA molekülünü ele alalım. Her birinin rekombinasyon sürecinde belli parçalar halinde olduğunu düşünelim. Daha sonra iki DNA molekülünün bölünen parçaları yer değiştirerek bir diğeriyle birleşir. Bu yeni oluşan iki adet DNA molekülüne “rekombinant DNA” denir. DNA segmentlerinin yer değiştirdiği bu mutasyon işlemine de “homolog veya genel rekombinasyon” adı verilir.

Biyolojide bir hücrenin DNA’yı alma kabiliyeti anlamındadır.

Kromozomal DNA’daki değişimlere ek olarak, ekstrakromozomal DNA veya genetik elementlerin kazanılması veya kaybedilmesi ile de varyasyonlar oluşur. Bu ekstrakromozomal genetik elementler plazmidler veya bakteriyofaj genetik elementleridir.

Transformasyon bakterinin ortamdaki çıplak DNA parçasını direkt olarak içine alması ve alınan DNA’nın kodladığı özellikleri kazanması demektir. Transformasyon için bakterinin belli bir sayıda olması ve bakteri yüzeyinin transformasyona hazır hale gelmesi gerekir. Bu hazır hale gelme durumuna kompetans denir. Bakteride kompetans oluştuktan sonra çift sarmallı DNA parçacıkları hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanır ve sadece bir sarmal bakteri içine alınır. Bazı bakteri türelerinde bu DNA girişinin aynı türden bakteriden olması gerekir. Örneğin N.meningitidis ve H.influenza bakterilerinde sadece sırasıyla 10 baz çifti (bp) ve 29 bp uzunluklarında DNA parçacıklarının sadece aynı türlerden transformasyonu söz konusu olabilir. Buna karşın B. subtilis ve S. pneumoniae gibi bakteri türlerinde tüm DNA, transformasyonla bakteriye girebilir. Eğer dışarıdan giren DNA tam kromozomal DNA ise replikasyonu için girdiği bakteri DNA’sı ile rekombine olması şarttır. Giren DNA ile konakçı bakteri DNA’sının homolog olması, yani aynı türden bakteriler arasında olması rekombinasyonu garantiler. Ancak ayrı türden bakterilerden gelen kromozomal DNA’larda konakçı bakteri DNA’sı arasında bazı benzer bölgelerin olması bile transformasyon sonu olan rekombinasyona yeterli bir durum teşkil eder. Genetik araştırmalarda DNA’nın suni yolla bazen konak bakterilere sokulması gerekir. Elektrik akımı yoluyla bakterilere DNA’nın suni transformasyon işlemine “elektroporasyon” adı verilir.

Konjugasyon bir verici (donör) bakteriden DNA transferi için gerekli genleri taşıyan bir plazmidin varlığında diğer alıcı bir bakteriye aktarılmasıyla gerçekleşir. E.coli ve diğer birçok Gram negatif bakterilerde verici hücre yüzeyinde pilus adıyla anılan borucuklar mevcuttur. Bu pilusların yapısı değişiklik gösterebilir. Örneğin F pilusları uzun, ince ve elastiktir. Buna karşın RP4 pilusu kısa, kalın ve serttir. Piluslar alıcı hücrenin yüzeyi üzerinde reseptörler ile ilişkiye girerler ve böylece çiftleşme başlar. Daha sonra piluslar alıcı hücrede bir kanal açarak DNA’nın geçişini sağlarlar. Bu geçiş replikatif bir işlemdir. Yani aktarımdan önce plazmid DNA’sı kopyalanarak bir kopyası aktarılır; diğeri verici bakteride kalır. Böylece plazmid populasyondaki diğer bakterilere aslında epidemik bir şekilde bulaştırılmış olur.

Plazmid haricinde E.faecalis bakterilerinde ayrıca gen aktarımına yol açan konjugatif transpozonlar mevcuttur. Aslında transpozonlar DNA içinde yer değiştiren genetik elementler olmalarına karşın, E.faecalis’te bulunan konjugatif transpozon olan Tn916 gibi transpozonlar konjugasyona neden olabilmektedir. Bu transpozonlar replike olur ve kromozomal DNA’nın bir parçası olarak kalıtımsaldır. Tn916 konjugatif transpozonların prototipidir. Bu tip transpozonlar Gram pozitif koklarda çok yaygındır, ayrıca benzer elementler Bacteroides gibi Gram negatif bakterilerde de saptanmaktadır. Konjugatif transpozonların DNA parçacıklarını diğer bakteri türleri ve genuslarına da aktarabildikleri ve böylece antibiyotik dirençlilik genleri dahil birçok genetik materyalin bakteriler arasında hızla yayılmasında çok önemli bir rol oynadıkları ortaya çıkmıştır. Örneğin Tn916 dahil çok sayıda konjugatif kromozom tetrasiklin direnç genini (tetM) çok değişik türde bakteri de taşımaktadır. Bu durum özgün bir genin bu transpozonlar tarafından tüm bakteriler arasında yayılabileceğini gösteren bir delildir.

Bakterilerdeki üçüncü tip genetik materyal aktarım yolu trandüksiyondur. Transdüksiyon genetik materyalin faj aracılığı ile aktarımıdır. Fajlar bakterilere özel viruslardır ve bakterilere yapışarak kendi genetik elementlerini bakterilere verirler, yani bakterileri infekte ederler. Fajlar bakterileri infekte ettikten sonra, infeksiyonun belli bir sürecinde onları lize ederler, diğer bir deyişle parçalarlar. Bu parçalanma sürecinde sadece fajın kendi DNA’sı faj kapsidi içine alınır. Bununla beraber bazı fajlar hata sonucu konak bakteri kromozomunu parçalar ve faj kapsidi içinde bir bakteri kromozom parçasını bulundurabilir. Bu barındırılan DNA parçaları bir başka alıcı bakteriyi infekte etme kabiliyetindedir. Tabii ki tüm bakteriyofajlar transdüksiyon oluşturma yetisinde değildir. Faj transdüksiyonu için temel bazı gereksinimler vardır. Bunlardan biri uygun büyüklükte kromozomal DNA parçacıklarının şekillenmesi için faj infeksiyonunun uygun düzeyde gerçekleşmesidir. Diğeri ise DNA’nın faj kapsidine paketlenmesi işleminin mümkün olduğu kadar spesifik olmamasıdır. 

Bir bakteriyofajın DNA’sının konak bakteri DNA’sına girerek o bakteriyi eritmeden, yani lize etmeden bakterinin yaşamını sürdürme durumudur.

Bir mikroorganizmanın hastalık oluşturma kabiliyetidir.

Mikrobiyolojideki genetik yöntemler mikroorganizmaların identifikasyonu, hasta örneklerinde aranması, genetik karakterlerinin ortaya koyulması, patojenite ve bağışıklık ile ilgili yapısal genetik komponentlerinin aranması ve incelenmesi, epidemiyolojileri, hastalık oluşturma yöntemleri (patogenesis) ve unsurları (virulens faktörleri), antibiyotik dirençliliklerinin hızlı tespiti ve mutasyonlarının incelenmesi gibi çok geniş bir kullanım alanına sahiptir.

Plazmid profil analizi ile bir bakterinin kaç tane ve hangi büyüklükte plazmid içerdiği saptanır ve diğer bakteri izolatlarıyla karşılaştırılır. Plazmid profil analizi için önce incelenecek bakteriler lize edilir, daha sonra özel bazı yöntemlerle izole edilen plazmid DNA’ları elektroforez denen bir yöntemle ayrılır. Daha sonra elektroforez işleminin uygulandığı jel boyanır ve ultraviyole ışığı altında incelenir. Böylece bakterilerin plazmid profili çıkarılmış olur. Plazmid profili belirlenmesi işlemi bakterilerin bir ön genetik tiplendirilmesi veya genotiplendirilmesi yöntemi olarak kabul edilir.

Nükleotid dizileme yöntemi ile incelenen DNA’daki nükleotidlerin hangi sırada bulundukları saptanır. Nukleotid dizilerinin saptanması üzerinden nukleotid kodonların kodladığı olası amino asitler ve dolayısıyla oluşacak polipeptid dizileri hakkında da bir fikir edinilebilir. Nükleotid dizileme DNA tiplendirmesi veya genotiplendirme açısından en temel metottur. DNA dizilemesi için iki popüler yöntemden yararlanılır. Bunlar Kimyasal Kesim Yöntemi (Chemical Clevage Method) ve Zincir Sonlandırma Yöntemi (Chain Terminator Method)’dir. Her iki yöntem de güncel olarak otomatize bir şekilde uygulanmaktadır ve dizileme sonuçları bir bilgisayar programı kullanımıyla analize edilmektedir. Nükleotid dizileme biraz zaman alıcı bir yöntem olmasına rağmen, DNA içindeki araştırılan genin tam dizi yapısı, mutasyon analizi yapılabilir. Aynı DNA bölgesi veya bölgeleri karşılaştırılarak bakteriler veya aynı bakterinin farklı izolatlarının birbirine genetik yakınlıkları saptanır. Ayrıca bir gen bölgesinin dizileme analizi sonucunda elde edilen bilgilere göre, başta polimeraz zincir reaksiyonu olmak üzere bazı genetik testlerde kullanılan oligonukleotid dizileri ve problarının dizaynı olanaklı olur.

Mikroorganizmalar dahil tüm organizmalardaki nükleoid dizilerinde polimorfizm veya çeşitlilik mevcuttur. RFLP tekniği mutasyonlar nedeni ile restriksiyon endonükleaz enzimleri denen DNA’yı kesen özgün enzimlerin DNA’yı spesifik olarak kestiği yerlerde ortaya çıkan nükleotid bazı değişimlerini ortaya koyma özelliğini taşır. DNA’daki restriksiyon bölgesi 4-12 nükleotid bazlık uzunluktadır. Hedeflenen bakteriyel kromozom bölgesi veya plazmid DNA önceden bilinen veya rastgele seçilen restriksiyon enzimi ile kesilir. İncelenen ve enzimle kesilen DNA bölgesi genellikle kesimden önce bir PCR işlemi ile çoğaltılır. Kesim sonrası oluşan DNA fragmanları elektroforesis ile agaroz veya poliakrilamid jel üzerinde ayrılır. Jelde ayrımdan sonra bandlar etidyum bromid adlı bir boya ile boyanır ve UV ışığı altında incelenir. Ayrılmış DNA parça sayıları, boyutları ve birbirinin üzerine binen bantların olup olmadığı incelenir. Bu bantları naylon membranlar üzerine aktarılabilir ve DNA’lar naylon membran üzerinde spesifik problarla hibridize edilerek saptanabilir.

RFLP epidemiyolojik bir değerlendirme ve bakteri izolatlarının tiplendirilmesi için çok kullanışlıdır. Aynı restriksiyon enzimlerinin kullanımıyla birden çok bakteri izolatının değerlendirilmesi ve genetik yakınlıklarının ve akrabalıklarının saptanması mümkündür. Bu yönteme DNA parmak izi saptama (DNA fingerprinting) yöntemi adı da verilir. Bu işlem insan ve hayvan hekimliğinde adli tıpta da aynı amaçla kullanılabilmektedir. RFLP tekniğinin bir diğer çok yaygın kullanımı “ribotiplendirme”dir. Bakteri ribozomunun ufak alt ünitesi olan 16S rRNA (yaklaşık 1500 baz çifti büyüklüktedir) bakterilerin en sabit dizisidir. Bu genetik yapı bakteri genusu veya türüne çok özgündür; yani o cinse veya türe aittir. Bu 16s rRNA dizisi RFLP’ye tabi tutularak, diğer bakterilerle genetik ilişkiler ortaya çıkarılabilir.

Elektrik Vurumlu Saha Jel Elektroforezisi (Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE); PFGE RFLP’ye benzer bir yöntemdir. Ancak burada enzimlerin kestiği DNA tüm bakteriyel kromozomdur. Hâlbuki RFLP’de kesilen kromozom veya plazmidin PCR ile artırılmış sadece bir bölgesidir. Bundan dolayı PFGE’de restriksiyon enzimleriyle kesim sonrası elde edilen DNA fragmanları RFLP’de oluşanlardan daha büyük boyuttadır. Bantları birbirinden ayrı bir şekilde görüntülemek için yapılan elektroforez işlemi özel bir elektroforesis donanımı ve yöntemi ile gerçekleştirilir. PFGE yöntemi epidemiyolojik yönden önemli olup, değişik kaynaklı ve farklı coğrafik bölgelerden elde edilen bakteri izolatlarının genetik ilişkilerinin saptanmasında çok önemli bir yer tutar.

Probun hedef DNA ile birleşme olgusuna “hibridizasyon” denir.Hibridizasyon işlemi sarmallar arasında homolojiyi veya eş olmayı gerektirdiğinden dolayı, her biri başka bir kökenden olan iki nükleik asit molekülü arasında oluşan bir hibridizasyon reaksiyonu nükleik asitlerin ait oldukları organizmalar arasındaki genetik yakınlığı gösterir. Hibridizasyon ile ölçüm için iki nükleik asit zincirinden birinin bilinen bir organizmadan olması gerekir. Diğer zincir ise identifiye edilecek veya aranacak olan organizmaya aittir. Hibridizasyon işleminde, klinik örnekten izole edilmiş DNA bir prob (işaretli bir DNA parçası) ile karıştırılır ve denaturasyon gerçekleştirilirse, DNA sarmalları birbirinden ayrılır. Denaturasyon koşulları ortadan kaldırılır ve durum normale getirilirse, prob dizisi ile DNA arasında eğer bir homoloji söz konusu ise birleşecektir

Bir DNA molekülünün iki sarmalı birbirinden yüksek sıcaklıklara tabi tutulduğunda, düşük tuz yoğunluklarında bulundurulduğunda veya değişik kimyasalların etkisiyle ayrılabilir. Bu denaturasyon veya ayrılma (melting) işlemi sıcaklığı düşürülmesi, tuz yoğunluğunun artırılması veya denature edici kimyasal etkenin ortamdan kaldırılması ile geri dönüştürülebilir. Ayrılan sarmallar tekrar çift sarmal halini alır. Bu işleme renaturasyon veya birleşme (annealing) denir.

Bir hibridizasyon denemesi için temel olarak hedef bir nükleik aside (DNA veya RNA), restriksiyon endonükleaz enzimine, işaretlenmiş problara, agaroz jel elektroforez cihazına, naylon veya nitroselüloz kağıtlara ve uygun koşullara ihtiyaç vardır.

Tipik hibridizasyon denemeleri şu basamaklardan oluşur: Tek zincirli probların üretimi ve işaretlenmesi, hedeflenen nükleik asit dizisinin tek zincirli hale getirilmesi, hedef ve prob DNA’larının birleşme için bir arada bırakılmaları ve hibridizasyon reaksiyonunun saptanması. Problar kısa nükleik asitlerdir ve bilinen hedef DNA’nın aranmasına yönelik olarak tasarlanır. Daha sonra problar hibiridizasyonun saptanabilmesi için işaretlenir. Bir probun sentezi için öncelikli olarak hedef DNA’nın nükleotid dizisi mutlaka bilinmelidir. Probların hazırlanmasında genellikle a. plazmidler, l fajları veya kozmidlere klonlama, b. yaklaşık 20 oligonükleotid bazı içeren probların kimyasal yolla sentezi, c.bilinen dizinin PCR ile çoğaltılması işlemleri kullanılır. Problar hibridizasyonu takiben hedef nükleik asit dizisinin saptanması için mutlaka daha önceden işaretlenmiş olmalıdır. İşaretleme radiyoaktif veya nonradiyoaktif maddelerle yapılır. 32P, 35S, 125I elementleri en çok kullanılan radyoaktif izotoplardır. Radyoaktif işaretlerle işaretli probların kullanıldığı durumlarda, hibridize olan DNA’lardaki birleşmenin olup olmadığı veya hibiridizasyon miktarı radyoaktivite ölçülerek gerçekleştirilir. Bu işlem için sintilografi ölçücüsü veya X-ışınımı otoradyografisi kullanılır.

Hibridizasyon uygulandığı ortama göre 2 grupta ele alınabilir: 1.Solusyon fazlı hibridizasyon sıvı ortamların içinde gerçekleştirilir. 2.Katı fazlı hibridizasyon (Bu tip hibridizasyonun önemli örnekleri Southern blot hibridizasyon, Northern blot hibridizasyon, Sandwiç hibridizasyon) naylon membranlar üzerinde veya ELISA pleytleri çukurlarında veya patolojik dokuların içinde gerçekleştirilir.

Nonradyoaktif problar biyotin, digoksigenin ve akridinum ester gibi kimyasallardır. Örneğin, biyotin B vitamininin ufak bir parçasıdır ve yumurta beyazında bulunan bir kimyasal olan avidin’e özgün olarak bağlanır. Her bir biyotin molekülü 4 adet avidin molekülüne bağlanabilir. Bundan dolayı biyotinli problar hibridize olduklarında, DNA aranması enzim bağlı avidin molekülleri ile yapılır. Daha sonra kullanılan enzimin özgün substratının ortama uygulanmasıyla, renk değişimi gözlenir. Digoksigenin işaretli probları aramak için ise enzim işaretli anti-digoksigenin antikorlarını kullanmak gerekir. Daha sonra uygun substrat katılarak reaksiyon gözlemlenir.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) çok az miktardaki DNA veya RNA molekülünün enzimatik olarak çok fazla miktara getirilmesidir. Bu sayede 1-2 kopya DNA milyonlarca kopyaya çoğaltılır. Dolayısıyla bu işleme nükleik asit arttırılması veya amplifikasyonu denir

PCR ile kısa bir süre içinde DNA veya RNA kopya sayısı yaklaşık107 adede arttırılabilir. PCR işlemi için işlemi başlatacak, aranan hedef DNA’nın her bir sarmalının bir ucuna spesifik olarak tasarlanmış ve sentezlenmiş bir çift başlatıcı DNA parçacığına gerek vardır. Başlatıcı bu moleküllere “primer” denir. Primerler DNA polimeraz enziminin de PCR içeriğine katılmasıyla uygun olduğu nükleotid dizilerine bağlanarak uzar. Böylece hedefin her sarmalından bir başka kopya sarmal sentezlenir ve sonuçta her bir DNA molekülü iki katına çıkmış olur.

PCR sonu elde edilen PCR ürünlerine “amplikon” denir.

PCR reaksiyonu içinde temel olarak bulunan materyaller şunlardır: hedef DNA, primerler, sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz enzimi, nükleotid bazları (Adenin, Timini Guanin, Sitozin), Su ve Magnezyum. İçine bu maddelerin konulduğu tüpler veya kapiller borucuklara ihtiyaç vardır.

Tipik bir PCR için uygulanan sıcaklık koşulları ve adları şunlardır. Önce 94-95C’de 15 sn-1dk denatürasyon, 52-60 C’ler arası 15 sn- 2 dk arası primerlerin hibridizasyonu ve 72 C’de 15 sn- 3 dk arası DNA polimeraz enziminin primerleri uzatması. Bu 3 aşamadan oluşan bir PCR döngüsü yaklaşık 25 ile 40 kez tüplere uygulanır ve PCR işlemi bitirilir.

PCR ürünleri daha sonra jel elektroforezisi ile klasik bir şekilde saptanabilir. Bunun haricinde ürünler gerçek zamanlı PCR (Real Time PCR) yöntemleriyle amplifikasyon sürecinde ve sonrasında belirlenebilir. Gerçek zamanlı PCR işlemlerinde ürünlerin teyidi uygulanan tekniğin türüne göre değişir. Örneğin SyberGreen boya tabanlı bir gerçek zamanlı PCR uygulandığında, amplikon özgünlüğü genellikle oluşan ürünün erime eğrisi sıcaklığı (Tm) analiz edilerek teyit edilir. Gerçek zamanlı PCR’da ayrıca ürünlerin özgünlüğü ve miktarı spesifik probların da kullanımıyla olanaklı hale getirilebilir.

DNA yerine RNA’nın PCR ile artırılabilmesi için önce RNA’nın DNA’ya çevrilmesi gerekir. Bu işlem ters transkriptaz (reverz transkriptaz) enzimi ve tek zincirli bir primer kullanımı ile yapılır. RNA’dan DNA oluşturma işlemine revers transkripsiyon denir ve bu işlem PCR öncesi uygulanarak hedef siklik DNA (cDNA) oluşturulmuş olur Daha sonra. cDNA templeyt olarak kullanılarak normal PCR işlemi uygulanır

PCR’ın değişik kullanım alanları olan tipleri bulunmaktadır. “Nested PCR”, bir PCR ürününün hedef DNA olarak kullanımıyla başka bir PCR uygulanması demektir. 

Multipleks PCR, birden fazla hedef DNA’nın birden fazla primer çifti kullanımı ile aynı anda çoğaltılması için yapılan PCR işlemidir.

Kompetetif PCR bir çift primer ile hedef DNA ve başka bir DNA’nın amplifikasyon için yarıştırılmasıdır.